劉有黃，徐　鋒，張征宇，葛京平，高建平，程　文

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科，南京 210002)

miR-487a在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

劉有黃，徐鋒，張征宇，葛京平，高建平，程文※

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科，南京 210002)

摘要：目的探討miRNA-487a在腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)中的表達(dá)及臨床意義。方法收集2011年1月至2012年12月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除的45例配對(duì)ccRCC組織及癌旁正常腎組織，常規(guī)提取45例新鮮ccRCC與癌旁組織中總RNA，應(yīng)用熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)標(biāo)本中miRNA-487a的表達(dá)狀況；分析miRNA-487a表達(dá)差異與臨床病理特征間的關(guān)系。結(jié)果與癌旁組織(1.00)比較，miRNA-487a在ccRCC表達(dá)水平為(3.30±1.03)，明顯上調(diào) (P<0.05) 。miRNA-487a的表達(dá)在不同腫瘤浸潤(rùn)程度及Fuhrman分級(jí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與年齡、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論miRNA-487a在腎透明細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可能為促進(jìn)ccRCC的發(fā)生、發(fā)展的因素之一。

關(guān)鍵詞：腎透明細(xì)胞癌；微RNA-487a；微RNA

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是成年人中最常見的一種腎臟惡性腫瘤[1-2]，對(duì)化療、放療均不敏感，其發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制至今仍不清楚，目前尚無明確的臨床應(yīng)用腫瘤標(biāo)志物。研究證明，微RNA(microRNA，miRNA)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。研究顯示，miRNA可能會(huì)成為一種潛在ccRCC的早期診斷、判斷預(yù)后和靶向治療的新途徑[4-5]。迄今為止，miRNA在ccRCC中的功能研究較少，提示這一領(lǐng)域的研究仍處在早期探索階段，有繼續(xù)深入探索的巨大空間。本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)ccRCC及癌旁組織中miRNA-487a表達(dá)，探討其與ccRCC發(fā)生的關(guān)系，以期為闡明ccRCC發(fā)生的分子機(jī)制提供新的依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料收集2011年1月至2012年12月在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除的45例配對(duì)ccRCC組織及癌旁正常腎組織，所有病例均行腎癌根治術(shù)?；颊吣?3例、女12例，年齡36～72歲，平均(47±5)歲；其中行根治性腎切除患者39例,腎部分切除術(shù)患者6例；按照世界衛(wèi)生組織分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理診斷:ccRCC 38例,腎乳頭狀細(xì)胞癌2例,腎嫌色細(xì)胞癌3例,其他類型2例；按照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：其中T1期25例,T2期8例,T3期7例,T4期5例,N0期40例,N1期5例,M0期41例,M1期4例；按照Fuhrman Grade分級(jí)為1級(jí)12例,2級(jí)18例,3級(jí)9例,4級(jí)6例。

1.2方法取材后沖去污物，轉(zhuǎn)存液氮中備用

1.2.1總RNA抽提及質(zhì)量檢測(cè)應(yīng)用Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，按說明書要求提取總RNA。使用Nanodrop ND-1000測(cè)定RNA濃度并評(píng)估純度，采用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.2.2miRNA芯片雜交采用miRCURYTMArray Power標(biāo)記試劑盒(上?？党缮镉邢薰緦?shí)驗(yàn)室提供)，按照說明書進(jìn)行芯片雜交。雜交后取出芯片，用miRCURYTM Array清洗緩沖試劑盒洗片，芯片干燥后立即使用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片，芯片圖像的原始熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)由GenePix pro V6.0完成分析。

1.2.3熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)miRNA-487a表達(dá)miRNA-487a及內(nèi)參U6均按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃，3 min；40個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃，15 s；60℃，20 s；72 ℃，20 s；78 ℃，20 s(收集熒光)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按以下程序進(jìn)行：95 ℃，2 min；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；99 ℃，15 s，并從72 ℃緩慢加熱到99 ℃(8 min)。相應(yīng)的PCR引物如下：U6正義鏈：5′GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3′，反義鏈：5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′，長(zhǎng)度 89 bp；miRNA-487a正義鏈：5′GGGAATCATACAGGGACAT3′，反義 鏈： 5′TGCGTGTCGTGGAGTC 3′，長(zhǎng)度62 bp。兩者均按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95 ℃，3 min；40個(gè)PCR循環(huán)[95 ℃，15 s；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；78 ℃，20 s(收集熒光)]。

1.2.4PCR產(chǎn)物的定量校正和判定分析通過Light Cycler軟件獲得miRNA-487a的循環(huán)閾值(Ct值)，計(jì)算ΔCt值，ΔCt=miR-487a Ct值-U6 Ct值，以2 -ΔΔ Ct表示miR-487a的相對(duì)表達(dá)水平，按目的基因表達(dá)量=2-ΔΔ Ct公式計(jì)算各樣本miRNA-487a的含量。

2結(jié)果

2.1RNA質(zhì)量鑒定變性瓊脂糖凝膠電泳后能觀察到28 s、18 s、 5.8 s(5 s),提示所提取的RNA完整可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分光光度法提示A260/A280的值為1.90～2.0，A260/A230的值為1.89～2.28。

2.2RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果miRNAs定量RT-PCR擴(kuò)增曲線和溶解曲線，顯示溶解曲線呈單峰引物，引物的特異性較好。見圖1、圖2。

2.3miRNA-487a在ccRCC中的表達(dá)及與腎癌臨床病理特征的關(guān)系miRNA-487a在ccRCC和癌旁組織中的表達(dá)水平分別為(3.30±1.03)和1.00，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miRNA-487a的表達(dá)與年齡、局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05)。miRNA-487a下調(diào)在T2~4期多于T1期、Fuhrman 分級(jí)3~4級(jí)多于1~2級(jí)(P<0.05)。見表1。

3討論

miRNAs是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的小分子非編碼RNA，其大小長(zhǎng)為20～25個(gè)核苷酸，miRNA與其靶mRNA的3′非編碼區(qū)特異性結(jié)合而介導(dǎo)翻譯水平的調(diào)控，調(diào)節(jié)了細(xì)胞生長(zhǎng)、組織分化等一系列生命過程[6-7]。已有研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可充當(dāng)癌基因、抑癌基因的角色，其表達(dá)與肺癌、胰腺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等多種癌癥相關(guān)[8]。miRNAs參與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展，可作為腫瘤診斷、預(yù)后的指標(biāo)及腫瘤治療新的靶點(diǎn)。miRNA具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性，這種特異性表達(dá)在臨床上將有助于對(duì)特定腫瘤的診斷、治療及預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。miR-487a定位于14號(hào)染色體，在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，在喉鱗狀細(xì)胞癌中下調(diào)[9]，而其在ccRCC惡性轉(zhuǎn)化中的作用機(jī)制目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道少見。

本研究結(jié)果顯示，miRNA-487a在ccRCC中高表達(dá)，提示miRNA-487a可能通過下調(diào)某抑癌基因的表達(dá)使正常的抑癌機(jī)制改變，從而導(dǎo)致腎細(xì)胞癌的發(fā)生。miR-487a在ccRCC組織中表達(dá)上調(diào)的機(jī)制目前較少見報(bào)道，但如DNA甲基化、組蛋白修飾失調(diào)等表觀遺傳學(xué)改變與ccRCC的發(fā)生和發(fā)展有

密切關(guān)系。池澤湃等[10]發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在腎細(xì)胞癌組織中顯著高表達(dá)，其可能在腎細(xì)胞癌的早期診斷、治療、判斷預(yù)后等方面具有重要意義。Shinmei等[11]提出，miRNA-155在ccRCC組織中低表達(dá)，可作為腎細(xì)胞癌預(yù)后標(biāo)志物。Doberstein等[12]發(fā)現(xiàn)，在腎癌中miRNA-145表達(dá)下調(diào)，引起整合素-金屬蛋白酶17的上調(diào)，從而導(dǎo)致腎癌的發(fā)生。miR-126在乳腺癌、腎癌組織中表達(dá)下調(diào)，可抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移[13-14]。本研究結(jié)果亦顯示，miR-487a在腎癌組織中的高表達(dá)與腎癌患者原發(fā)腫瘤的分期、Fuhrman分級(jí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有助于臨床選擇治療方案和估計(jì)預(yù)后。

本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)ccRCC及癌旁組織中miRNA-487a表達(dá)，結(jié)果顯示miRNA-487a在ccRCC中高表達(dá)，并經(jīng)定量RT-PCR驗(yàn)證證實(shí)，微陣列基因芯片的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，提示miR-487a在腎癌組織中高表達(dá)，可能為促進(jìn)ccRCC的發(fā)生、發(fā)展的因素之一。目前miRNA-487a調(diào)控腫瘤細(xì)胞的發(fā)病機(jī)制尚未明確，有待在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

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更正說明：

《醫(yī)學(xué)綜述》2015年第17期第3256頁“ⅢA期肺癌胸腔鏡輔助小切口治療后的療效及生存分析”一文中的作者“李占新”更正為“李占欣”。2015年第23期第4356頁“電視胸腔鏡下肺癌切除后患者預(yù)后影響因素分析”一文中的作者“李占新”更正為“李占欣”。

The Expression and Clinical Significance of miRNA-487a in Clear Cell Renal Cell CarcinomaLIUYou-huang,XUFeng，ZHANGZheng-yu，GEJing-ping，GAOJian-ping，CHENGWen.(DepartmentofUrology,NanjingGeneralHospitalofPLANanjingMilitaryCommand，Nanjing210002，China)

Abstract：ObjectiveTo detect the expression and clinical significance of miRNA-487a in clear cell renal cell carcinoma(ccRCC).MethodsccRCC and corresponding adjacent tissues of 45 patients admitted to the Department of Urology,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command from Jan.2011 to Dec.2012 were collected and the total RNA was extracted routinely.The miRNA-487a expression was detected by using fluorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction.The correlations of miRNA-487a expression with the clinicopathologic characteristics was analyzed.ResultsThe miRNA-487a expression level of ccRCC tissue was (3.30±1.03),which was significantly higher than the adjacent tissue(P<0.05).The expression of miRNA-487a had statistically significant difference between different invasion degrees and Fuhrman gradings(P<0.05),but showed no significant correlations with the patients′age,histological type of the tumor,lymph node metastasis and distal metastasis(P>0.05).ConclusionThe up-regulated expression level of miRNA-487a in ccRCC is correlated with invasion degree and Fuhrman grading,and it may participate in the pathogenesis and development of ccRCC.

Key words：Clear cell renal cell carcinoma; miRNA-487a; MicroRNA

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-05-25編輯：伊姍

基金項(xiàng)目：南京軍區(qū)南京總醫(yī)院院內(nèi)課題(2012034)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.24.042

中圖分類號(hào)：R737.14

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)24-4536-03