宋 曉，席 強，王 剛

(1.河北北方學院附屬第一醫(yī)院放療科，河北 張家口 075000；2.四川大學國家生物醫(yī)學材料工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610064)

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·論 著·

肺腺癌轉(zhuǎn)移機制的研究與探討

宋 曉1，席 強1，王 剛2

(1.河北北方學院附屬第一醫(yī)院放療科，河北 張家口 075000；2.四川大學國家生物醫(yī)學材料工程技術(shù)研究中心，四川 成都 610064)

目的篩選轉(zhuǎn)移性肺腺癌組織與相應正常組織之間的差異基因表達圖譜。方法利用現(xiàn)代高通量表達譜芯片技術(shù)比較4對轉(zhuǎn)移性肺腺癌組織與其相應正常組織之間的差異基因表達圖譜。通過文獻挖掘和生物信息學方法分析顯著性差異表達基因的功能。結(jié)果與正常組織比較，在轉(zhuǎn)移性肺腺癌組織中發(fā)現(xiàn)了46個顯著性差異表達基因，其中包括24個高表達的差異基因(USP33、FOXC1和PPBP等)和22個低表達的差異基因(SPATA13、SBF1和TFIP11等)。生物信息學分析表明，這些基因在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用。結(jié)論基因表達圖譜的改變與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

肺腫瘤；腫瘤轉(zhuǎn)移;基因表達譜doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.026

21世紀，肺癌在世界范圍內(nèi)是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，5年生存率僅為5%～8%[1-2]。轉(zhuǎn)移是癌癥最主要的惡性標志和特征之一，也是導致癌癥治療失敗和癌癥患者死亡的最主要原因，80%～90%肺癌患者死亡是由轉(zhuǎn)移引起的[3-5]。轉(zhuǎn)移形成最關(guān)鍵的異常通路包括酪氨酸激酶受體、上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)型、腫瘤血管形成等[6]。但是，對于腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中的很多機制還知之甚少。本研究利用全基因組表達譜芯片技術(shù)，篩選轉(zhuǎn)移性肺腺癌患者的癌組織與相應正常組織之間的差異基因表達圖譜，旨在為腫瘤轉(zhuǎn)移的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)和支撐。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1—12月河北北方學院附屬第一醫(yī)院轉(zhuǎn)移性肺腺癌患者4例的癌組織樣本和相應正常組織樣本。所有患者的組織樣本都經(jīng)過病理科2位資深病理專家的診斷，保證組織樣本病理資料的可靠性與取材樣本的準確性。在樣本取材之前，患者以及家屬均簽署知情同意書，并經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的同意。臨床患者信息見表1。

表1 患者臨床信息

1.2RNA抽提和純化 采用RNeasyMiniKit(QIAGEN)并且根據(jù)生產(chǎn)廠商提供的標準操作流程進行樣品的總RNA抽提，抽提所得總RNA經(jīng)安捷倫2100生物分析儀電泳質(zhì)檢合格后備用。

1.3 樣品RNA的放大和標記 樣本RNA采用Agilent表達譜芯片配套試劑盒，單色標記試劑盒和標準操作流程對樣品總RNA中的mRNA進行放大和標記，并用RNeasyMiniTit(QIAGEN)純化標記后的cRNA。

1.4 芯片雜交 按照Agilent表達譜芯片配套提供的雜交標準流程和配套試劑盒，在滾動雜交爐中65 ℃，10r/min，滾動雜交17h，雜交cRNA上樣量1.65μg，并在洗缸(ThermoFisher)中洗片，洗片所用的試劑為基因表達譜芯片洗脫緩沖液試劑盒。

1.5 芯片掃描 完成雜交的芯片采用安捷倫芯片掃描儀進行掃描，用FeatureExtractionSoftware10.7讀取數(shù)據(jù)，最后采用GeneSpringSoftware11.0進行歸一化處理，所用的算法為Quantile。

1.6 差異基因篩選 用基因芯片顯著性分析(SignificantAnalysisofMicroarray，SAM)方法篩選具有差異表達的基因。

1.7 生物信息學分析

1.7.1 基因本體論(geneontology,GO)分析 通過TheGeneOntology數(shù)據(jù)庫，GO分析可以分析差異表達基因的主要功能。Fisher檢驗和χ2檢驗來區(qū)分和選擇顯著性的GO亞類，GO校驗計算返回的富集度P值表明GO功能是否具有顯著性。

1.7.2Pathway(通路)分析 利用KEGG、Biocarta等數(shù)據(jù)庫，通路分析可以發(fā)現(xiàn)差異表達基因的顯著性通路。Fisher檢驗和χ2檢驗用來選擇顯著性的通路，P值和誤判率(falsediscoveryrate，F(xiàn)DR)值用來定義顯著性的閾值。

1.8 統(tǒng)計學方法 應用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料比較采用Fisher檢驗和χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)移性肺腺癌組織與相應正常組織之間的差異基因表達圖譜 為了研究轉(zhuǎn)移性肺腺癌組織與相應正常組織之間的差異基因表達圖譜，篩選出肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，了解肺腺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制，本研究利用Agilent人類基因表達譜芯片(AgilentWholeHumanGenomeOligoMicroarray，4*44K)區(qū)分了轉(zhuǎn)移性肺腺癌組織與相應正常組織之間的全基因組表達圖譜。嚴格按照Agilent表達譜芯片的質(zhì)控標準，以基因表達量改變倍數(shù)>2和P<0.05為篩選標準，選出的差異mRNA作為候選基因。在二維基因聚類圖譜中，每一列代表了樣本，每一行代表了探針I(yè)D(基因)，顏色的深淺代表了每一個基因在不同樣本中的相對表達量。同時，從聚類圖譜中可以發(fā)現(xiàn)樣本的分組情況比較好(圖1)。

2.2 46個候選的差異基因的表達情況 按照上述嚴格的數(shù)據(jù)處理和篩選標準，與正常組織相比，在轉(zhuǎn)移性肺腺癌組織中，共發(fā)現(xiàn)了46個顯著性的差異表達基因，其中24個差異基因是高表達的，22個差異基因是低表達的。在24個上調(diào)的差異表達基因中，泛素特異性肽酶33(ubiquitinspecificpeptidase33，USP33)是上調(diào)倍數(shù)最多的基因(基因表達變化倍數(shù)=13.48，P=0.000 01)。在22個下調(diào)的差異表達基因中，釉叢蛋白星湖作用蛋白11(tuftelininteractingprotein11，TFIP11)是下調(diào)倍數(shù)最多的基因(基因表達變化倍數(shù)=7.93，P=0.000 18)。見表2。

表2 46個候選差異基因的表達情況

表2 (續(xù))

2.3 文獻挖掘 通過文獻挖掘，發(fā)現(xiàn)在上述46個顯著性差異表達基因中，一些基因已經(jīng)被報道和研究過與腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)生有關(guān)，特別是叉頭框蛋白C1(forkheadboxC1,FOXC1)、小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物(FBJmurineosteosarcomaviraloncogenehomolog，F(xiàn)OS)、視神經(jīng)萎縮基因1(opticatrophy1，OPA1)、zincfingerandBTBdomaincontaining7A(ZBTB7A)、Thetuberoussclerosis-1(TSC1)這幾個基因，它們的表達與功能在很多腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用。

2.4 生物信息學分析 為了更好地理解和發(fā)現(xiàn)這些顯著性差異表達基因在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中的作用，本研究利用生物信息學方法對這些基因進行了GO和Pathway的深入分析。利用TheGeneOntology數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)這些顯著性差異表達基因主要影響了16條GO功能(圖2)，其中影響最顯著的GO為細胞凋亡，還有轉(zhuǎn)座酶活性等。利用KEGG等數(shù)據(jù)庫進行通路分析，發(fā)現(xiàn)了20條顯著性通路(圖3)，其中最顯著的信號通路是IL-6信號通路(IL-6signalingpathway)，還有NK細胞介導細胞毒性的Ras信號通路(Ras-IndependentpathwayinNKcell-mediatedcytotoxicity)等。

3 討 論

本研究利用現(xiàn)代高通量人類表達譜芯片技術(shù)[7-8]，比較了轉(zhuǎn)移性肺腺癌患者的癌組織與相應正常組織之間的全基因組表達圖譜。按照表達譜芯片的嚴格質(zhì)控標準，以差異倍數(shù)>2和P<0.05為篩選標準，在轉(zhuǎn)移性肺腺癌與相應正常組織之間共篩選出了46個顯著性的差異表達基因。與正常組織相比，在轉(zhuǎn)移性肺腺癌組織中有24個差異基因是上調(diào)表達的，22個差異基因是下調(diào)表達的。在24個上調(diào)的顯著性差異表達基因中，USP33是上調(diào)倍數(shù)最多的基因；而在22個下調(diào)基因中，TFIP11是下調(diào)倍數(shù)最多的基因。這些顯著性差異表達基因可能在肺腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的作用。

通過文獻挖掘分析，發(fā)現(xiàn)上述46個顯著性差異表達基因，其中一些基因已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)和研究過與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)USP33的表達水平是Slit信號抑制結(jié)腸癌細胞遷移的一個重要因素[9]。叉頭框蛋白1(forkheadboxC1，F(xiàn)OXC1)也是上調(diào)倍數(shù)比較明顯的基因，已有相當多的文獻報道它與癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)。FOXC1的高表達發(fā)生在胰腺導管癌、非小細胞癌、肝癌、乳腺癌等，它的表達與這些腫瘤的發(fā)生和預后密切相關(guān)[10-12]。同時，F(xiàn)OXC1的高表達可以通過誘導上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換發(fā)生和上調(diào)神經(jīng)前體細胞表達、發(fā)育調(diào)控蛋白9基因(neuralprecursorcellexpressed,developmentallydown-regulated9，NEDD9)的表達來促進肝細胞癌的轉(zhuǎn)移[12-13]。另外，F(xiàn)OXC1也可以通過誘導基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrixmetalloproteinase7，MMP7)的表達來促進乳腺癌的侵襲能力[14],FOXC1的過表達在非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移和發(fā)生中有重要作用，可以作為非小細胞肺癌治療和預后的一個標志物[15]。視神經(jīng)萎縮蛋白1(opticatrophy1,OPA1)在肺腺癌中是高表達的，可以預示肺腺癌的預后較差；OPA1突變也在很多疾病中發(fā)揮著重要作用[16-17]。ZBTB7A(又稱作LRF、ZBTB7或pokemon等)在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝細胞癌中都是過表達的，它的過表達可以增加腫瘤的惡性程度和耐藥性[18-20]。在轉(zhuǎn)移性腺癌組織中低表達的22個顯著性差異表達基因中，SPATA13(Spermatogenesis-associatedprotein13，又名Asef2)可以通過調(diào)控Rho-familyGTPases的活性來促進癌細胞的遷移和快速粘連運輸[21]，同時Asef2在結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[22]。SIRT3在肝細胞癌中是低表達的，作為一個腫瘤抑制因子，它可以通過影響肝癌細胞的增殖和入侵從而發(fā)揮重要作用[23]；過表達SIRT3可以抑制乳腺癌細胞的糖酵解過程和細胞增殖過程，為抑制腫瘤的發(fā)生提供了一種代謝機制[24]。除了上述描述的基因外，在轉(zhuǎn)移性腺癌組織中高表達的基因E2F6(E2Ftranscriptionfactor6)、ACRBP(acrosinbindingprotein)、ARL6IP1(ADP-ribosylationfactor-likeprotein6-interactingprotein1)，低表達的基因TSC1、PKNOX1(PBX/knotted1homeobox1)等基因與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

為了更加深入地了解這些顯著性差異表達基因在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮的重要作用，本研究利用生物信息學方法對這些基因進行了GO和Pathway分析。通過TheGeneOntology數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)了16條顯著性GO，其中包括細胞凋亡、轉(zhuǎn)座酶活性等。通過KEGG數(shù)據(jù)庫進行Pathway分析，篩選出20條顯著性Pathway，包括IL-6信號通路(IL-6signalingpathway)、自然殺傷細胞介導細胞毒性的Ras信號通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路等。其中一些重要的通路，如Ras通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中都發(fā)揮著重要的作用[25-27]。

本研究結(jié)果表明，在肺腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中，基因表達圖譜會發(fā)生很多變化，尤其是一些與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因。通過區(qū)分轉(zhuǎn)移性肺腺癌組織與正常組織之間的全基因組表達譜，可以為臨床治療提供參考數(shù)據(jù)?？傊没虮磉_譜來區(qū)分、預測、治療肺腺癌可能會成為未來臨床應用的一個很好的工具。(本文圖見封三)

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(本文編輯：趙麗潔)

2015-04-01；

2015-06-30

國家自然科學基金資助項目(31370972)

宋曉(1975-)，男，山東乳山人，河北北方學院附屬第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事腫瘤放射治療研究。

R

B

1007-3205(2015)11-1332-06