陳麗云，鄭麗華，羅 飛，張 玉，蘇素文

(1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北省正定縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 正定 050800；3.河北省正定縣疾病控制中心計劃免疫科，河北 正定 050800；4.河北省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院生殖醫(yī)學(xué)中心，河北 石家莊 050071)

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·論 著·

緩激肽受體拮抗劑對卵巢癌細(xì)胞的作用

陳麗云1,2，鄭麗華2，羅 飛3，張 玉4，蘇素文1*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河北 石家莊 050017；2.河北省正定縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 正定 050800；3.河北省正定縣疾病控制中心計劃免疫科，河北 正定 050800；4.河北省計劃生育科學(xué)技術(shù)研究院生殖醫(yī)學(xué)中心，河北 石家莊 050071)

目的探討緩激肽B2受體特異性拮抗劑艾替班特(HOE-140)單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用阿霉素(doxorubicin,DOX)對人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 的影響及可能的作用機(jī)制。方法采用MTT法檢測不同濃度的DOX或HOE-14與SKOV3作用24h后細(xì)胞的存活情況。在此基礎(chǔ)上，比較二者聯(lián)合用藥和分別單獨(dú)應(yīng)用相同劑量的DOX或HOE-140 對SKOV3的細(xì)胞毒作用及對SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果不同濃度的DOX或HOE-140與SKOV3共同孵育24h后，均對SKOV3細(xì)胞的增殖有一定抑制作用。二者聯(lián)合應(yīng)用對SKOV3細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用(P<0.05)。二者聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞的凋亡作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用。結(jié)論緩激肽受體拮抗劑HOE-140對SKOV3細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，并可促進(jìn)其凋亡。

卵巢腫瘤；受體，緩激肽B2；表柔比星doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.11.007

卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的三大惡性腫瘤之一，其中上皮性卵巢癌占卵巢惡性腫瘤的85%～90%，其常用的治療方案為手術(shù)加化療，但是多數(shù)患者停藥一段時間后會復(fù)發(fā)，這可能與卵巢癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚和腫瘤的耐藥有關(guān)[1]。卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，目前普遍認(rèn)可的觀點(diǎn)是與卵巢持續(xù)排卵誘發(fā)的慢性炎癥有關(guān)[2]。緩激肽(bradykinin,BK)是機(jī)體炎癥時釋放的一種血管活性肽[3]，通過與細(xì)胞膜上的B1受體和B2受體結(jié)合產(chǎn)生作用[4]。本研究觀察BKB2受體特異性拮抗劑艾替班特(HOE-140)單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用阿霉素(doxorubicin,DOX)對人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3 的影響及可能的作用機(jī)制，旨在找到更好的腫瘤靶位，從而改善卵巢癌患者的生存質(zhì)量?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源 實驗所用的卵巢癌SKOV3細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供，HOE-140由BIOMOL公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1DOX和HOE-140 單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對SKOV3 細(xì)胞增殖的影響 采用MTT法檢測不同濃度DOX(3、10、30、100、300μmol/L)或HOE-140(0.01、0.1、1、10、100μmol/L)對SKOV3作用24h后細(xì)胞的存活情況。在此基礎(chǔ)上，比較二者聯(lián)合用藥(DOX10μmol/L+HOE-140 10μmol/L)和分別單獨(dú)應(yīng)用相同劑量的DOX或HOE-140 對SKOV3的細(xì)胞毒作用。原理：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在 490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比，從而檢測細(xì)胞增殖及抑制率。

1.2.2DOX和HOE-140 單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響 采用DOX10μmol/L、HOE-140 10μmol/L、DOX10μmol/L+HOE-140 10μmol/L聯(lián)合應(yīng)用作用SKOV3細(xì)胞24h，采用原位末端標(biāo)記技術(shù)觀察細(xì)胞凋亡情況。原理：細(xì)胞在發(fā)生凋亡時，會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA?；蚪MDNA斷裂時，暴露的3′-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下加上熒光素標(biāo)記的dUTP，從而可以通過熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料比較分別采用F檢驗和q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2種藥物對SKOV3細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測結(jié)果顯示，不同濃度的DOX(3、10、30、100、 300μmol/L)或HOE-140(0.01、0.1、1、10、100μmol/L)作用SKOV3細(xì)胞24h后，均對SKOV3細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制作用越來越強(qiáng)(圖1，2)。HOE-140 10μmol/L和DOX10μmol/L對SKOV3細(xì)胞的抑制率分別為 12.7%和26.8%，而DOX10μmol/L+HOE-140 10μmol/L聯(lián)合應(yīng)用的抑制率為37.5%，對SOV3細(xì)胞的抑制作用明顯強(qiáng)于二者單獨(dú)應(yīng)用(P<0.05)(圖3)。

2.2 2種藥物對SKOV3細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色顯示單獨(dú)應(yīng)用HOE-140 10μmol/L或DOX10μmol/L處理SKOV3細(xì)胞24h均可誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡，而DOX10μmol/L+HOE-140 10μmol/L聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞的凋亡作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用(圖4)。

3 討 論

卵巢位于盆腔深部，早期病變不易發(fā)現(xiàn)，晚期病例也缺乏有效的治療手段，因此卵巢惡性腫瘤致死率居婦科惡性腫瘤首位，已成為嚴(yán)重威脅婦女生命和健康的主要疾病。卵巢癌的組織類型繁多，其中上皮性卵巢癌最為多見。手術(shù)加化療是卵巢癌常用的治療方案，化療作為卵巢癌重要的治療方法，其方案的選擇尤其重要，同時化療的不良反應(yīng)也會凸顯出來。DOX是最有效的化療藥物之一，臨床廣泛用于多種惡性腫瘤如乳腺癌、淋巴瘤、肺癌及卵巢癌等，然而劑量依賴性心臟毒性限制了DOX在臨床的應(yīng)用，如何減輕其心臟毒性癥狀并增強(qiáng)其抗腫瘤療效，成為目前亟待解決的問題。

BK是機(jī)體一種非常重要的促炎癥反應(yīng)肽類物質(zhì)，在組織損傷后介導(dǎo)眾多的血管和炎癥反應(yīng)。BK對機(jī)體的作用通過與BK受體(B1R和B2R)結(jié)合起效。B1R和B2R均為G蛋白偶聯(lián)受體。其中B2R在組織中固有表達(dá)，與BK親和力高；B1R正常情況下幾乎不表達(dá)，與BK的親和力低，炎癥及損傷等情況下表達(dá)量大大增加，故屬誘導(dǎo)型受體。多種因素如多種促炎因子(白細(xì)胞介素1)、生長因子(上皮細(xì)胞生長因子、腫瘤壞死因子以及脂多糖)及受體激動劑等均可促使B1R表達(dá)上調(diào)。BK與其受體結(jié)合后可激活多種信號通路[5-7]。其中蛋白激酶C通道可通過激活細(xì)胞內(nèi)的第二信使(Ca2+)導(dǎo)致一氧化氮的產(chǎn)生增加[8-9]。

我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，DOX一次大量給藥(20mg/kg)所致的急性心肌損傷癥狀在BK受體基因敲除小鼠明顯輕于野生型小鼠，且心肌組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)明顯減弱，提示BK所介導(dǎo)的一氧化氮信號通路可參與DOX所致的心臟毒性，而阻斷這一信號通路則可減輕損傷。最近的研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤如卵巢癌、胃癌和肝癌的的腹腔滲液[10-11]中均有高水平的BK，提示BK可能參與惡性腫瘤的發(fā)生，BK受體有望成為惡性腫瘤的治療靶位[8]。但目前對其亞型在腫瘤中的表達(dá)及各亞型所起的作用研究尚少，且結(jié)果也不一致[8,12]。因此，有必要深入研究BK各亞型及其介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生及增殖中的作用，這將有助于更好地了解腫瘤的發(fā)生和增殖機(jī)制，以便為臨床更好的聯(lián)合用藥提供實驗基礎(chǔ)。

Kuhr等[13]研究認(rèn)為，在內(nèi)皮細(xì)胞，B2R的激活導(dǎo)致Gαq/11的活化，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮型一氧化氮合酶的激活，使一氧化氮瞬時、小量的升高，而B1R被激活后則可通過G蛋白ai亞單位、βγ亞單位和惡性腫瘤基因依賴性ERK/MAP激酶的激活導(dǎo)致一氧化氮含酶的激活[14]。但這一信號通路在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中是否仍然起作用有待進(jìn)一步實驗證實。

目前，BK受體拮抗劑已被試用于多種腫瘤，特別是肺癌和前列腺癌的治療[8,10]。但其試用于卵巢癌的研究尚少[12]。

本研究采用人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)B2R的特異性拮抗劑HOE-140對卵巢癌細(xì)胞的增殖有輕度的抑制作用，且可增敏DOX的作用，進(jìn)一步證實B2受體可參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。對經(jīng)不同處理的SKOV3細(xì)胞做TUNEL染色后發(fā)現(xiàn)，HOE-140和DOX均可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡。HOE-140作為BKB2R的特異性拮抗劑，可直接抑制BK介導(dǎo)的作用。因此，HOE-140有望成為一種新的、有潛力的抗卵巢癌的藥物。

腫瘤的發(fā)生是多因素協(xié)同作用的結(jié)果,隨著人們對BK及其受體的深入研究,BK及其受體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用和確切的作用機(jī)制，以及在腫瘤臨床應(yīng)用中的價值將逐漸被闡明。本研究結(jié)果顯示，BK受體特別是B2R在卵巢癌的發(fā)生中有非常重要的作用，其拮抗劑對卵巢癌SKOV3細(xì)胞的生長有一定的抑制作用，同時可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，所以BKB2R拮抗劑有望成為卵巢癌治療的新靶點(diǎn)。不過迄今為止，有關(guān)HOE-140的抗卵巢癌作用一直沒有明確的報道，就目前總體而言，對HOE-140的藥理作用尚了解不多。

綜上所述，BK受體拮抗劑HOE-140 和DOX均對SKOV3細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用，其作用可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制一氧化氮產(chǎn)生有關(guān)。(本文圖見封三)

[1]XuTT.ChineseAnti-CancerAssociationasanon-governmentalorganizationundertakessystematiccancerpreventionworkinChina[J].ChinJCancerRes,2015,27(4):423-428.

[2] 李杰.卵巢漿液性癌的細(xì)胞起源研究[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2012.

[3]ArakiY,BambaT,MukaishoK,etal.Dextransulfatesodiumadministeredorallyisdepolymerizedinthestomachandinducescellcyclearrestplusapoptosisinthecoloninearlymousecolitis[J].OncolRep,2012,28(5):1597-1605.

[4]C?téJ,SavardM,NeugebauerW,etal.DualkininB1andB2receptoractivationprovidesenhancedblood-brainbarrierpermeabilityandanticancerdrugdeliveryintobraintumors[J].CancerBiolTher,2013,14(9):806-811.

[5]GrecoS,EliaMG,MuscellaA,etal.Bradykininstimulatescellproliferationthroughanextracellular-regulatedkinase1and2-dependentmechanisminbreastcancercellsinprimaryculture[J].JEndocrinol,2005,186(2):291-301.

[6]ToledoC,MatusCE,BarrazaX,etal.ExpressionofHER2andbradykininB1receptorsinprecursorlesionsofgallbladdercarcinoma[J].WorldJGastroenterol,2012,18(11):1208-1215.

[7]ZhangY,CardellLO,EdvinssonL,etal.MAPK/NF-κB-dependentupregulationofkininreceptorsmediatesairwayhyperreactivity:anewperspectiveforthetreatment[j].PharmacolRes,2013,71:9-18.

[8]DaCostaPL,SiroisP,TannockIF,etal.Theroleofkininreceptorsincancerandtherapeuticopportunities[J].CancerLett,2014,345(1):27-38.

[9]MeottiFC,CamposR,daSilvaK,etal.InflammatorymusclepainisdependentontheactivationofkininB1andB2receptorsandintracellularkinasepathways[J].BrJPharmacol,2012,166(3):1127-1139.

[10] 陳麗云.緩激肽受體介導(dǎo)的NO信號通路在卵巢癌發(fā)生中的作用[D].石家莊:河北醫(yī)科大學(xué),2014.

[11]KobayashiH,OkadaY,AsahinaT,etal.Thekallikrein-kininsystem,butnotvascularendothelialgrowthfactor,playsaroleintheincreasedvascularpermeabilityassociatedwithovarianhyperstimulationsyndrome[J].JMolEndocrinol,1998,20(3):363-374.

[12]JutrasS,BachvarovaM,KeitaM,etal.StrongcytotoxiceffectofthebradykininantagonistBKM-570inovariancancercells-analysisofthemolecularmechanismsofitsantiproliferativeaction[J].FEBSJ,2010,277(24):5146-5160.

[13]KuhrF,LowryJ,ZhangY,etal.DifferentialregulationofinducibleandendothelialnitricoxidesynthasebykininB1andB2receptors[J].Neuropeptides,2010,44(2):145-154.

[14]BrovkovychV,ZhangY,BrovkovychS,etal.Anovelpathwayforreceptor-mediatedpost-translationalactivationofinduciblenitricoxidesynthase[J].JCellMolMed,2011,15(2):258-269.

(本文編輯：趙麗潔)

The role of bradykinin receptor antagonists in ovarian cancer

CHENLi-yun1,2，ZHENGLi-hua2，LUOFei3，ZHANGYu4，SUSu-wen1*

(1.Department of Pharmacy,the School of Basic Medicine,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China;2.Department of Obstetrics and Gynecology,the People's Hospital of Zhengding County,Hebei Province,Zhengding 050800,China; 3.Department of Immunology,Disease Control Center of Zhengding County,Hebei Province,Zhengding 050800,China； 4. Department of Reproductive Medicine Center，Research Institute for Family Planning of Hebei Province，Shijiazhuang 050071，China)

ObjectiveToinvestigatetheinhibitoryeffectsofB2receptorantagonistHOE-140aloneorincombinationwithdoxorubicin(DOX)onhumanovariancancercelllines(SKOV3)andpossiblemechanismsofaction.MethodsSKOV3cellswereculturedinthepresenceofdifferentconcentrationsofHOE-140orDOXfor24h.Then,thesameconcentrationsofHOE-140andDOXaloneorincombinationwereusedtoobservethesynergisticinteractionandtheinfluenceonapoptosisofSKOV3cells.ResultsBothHOE-140andDOXinhibitedtheproliferationofSKOV3cellsinaconcentration-dependentmanner.TheeffectofcombinationonSKOV3cellsshowedasynergisticeffects(P<0.05).Thecombinationeffectofthetwodrugswasstrongerthanmedicationalone.ConclusionBradykininreceptorantagonistHOE-140inhibitedtheproliferationofSKOV3cellsandcanpromoteapoptosis.

ovarianneoplasms;receptor,bradykininB2;epirubicin

2015-07-28；

2015-08-31

國家自然科學(xué)基金課題(81273600)；河北省自然科學(xué)基金課題(2011206145)

陳麗云(1976-)，女，河北正定人，河北省正定縣人民醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事婦產(chǎn)科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:suswmk@163.com

R

A

1007-3205(2015)11-1264-04