李澤鋒，魏 攀，夏玉珍，王 中，武明珠，王 燃，羅朝鵬，金立鋒，楊 軍，林福呈，李 鋒*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

2.紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南省玉溪市紅塔大道118 號 653100

牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（Geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）催化異戊烯基二磷酸（Isopentenyl diphosphate，IPP）和法尼基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP）的縮合反應(yīng)，形成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）。GGPP 是在植物生長發(fā)育過程中具有重要功能的多種萜類化合物的共同前體物，能起到調(diào)節(jié)“碳流”的作用，還能催化蛋白的異戊二烯化，是植物萜類化合物代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶［1］。植物中的GGPPS 是由大亞基和小亞基構(gòu)成的異源二聚體，大亞基具有合成GGPP 的活性，而小亞基沒有，但兩個(gè)亞基結(jié)合后活性則明顯提高［2］。GGPPS 基因最早是從辣椒中克隆得到［3］，之后在其他多種植物中亦被克隆出。近年來，GGPPS 基因在功能研究上取得了一些進(jìn)展。但在啤酒酵母中GGPPS 基因過表達(dá)，會導(dǎo)致β-胡蘿卜素含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）顯著增加［4］。在法夫酵母和卷枝毛霉中，GGPPS 過表達(dá)也能顯著提高類胡蘿卜素產(chǎn)量［5-6］。有研究發(fā)現(xiàn)，在漸窄葉煙草中對GGPPS 沉默后，二萜類物質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）顯著下降，更易受到象鼻蟲幼蟲的侵害［7］。甲基茉莉酮酸可以誘導(dǎo)GGPPS 表達(dá)量大大提高，同時(shí)二萜含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）也大幅度增加［8］。目前，普通煙草GGPPS 基因家族有4 個(gè)成員（3 個(gè)大亞基和1 個(gè)小亞基）被克隆出來，研究發(fā)現(xiàn)其參與了煙草萜類化合物的合成。煙草萜類化合物與煙草香氣密切相關(guān)，因此GGPPS 基因?qū)煵萆L發(fā)育和品質(zhì)性狀起著重要作用［9-11］。目前人們對于煙草萜類化合物的合成代謝調(diào)控還了解較少［12］。煙草全基因組測序的完成正在改變煙草分子生物學(xué)研究相對滯后的局面，為從全基因組水平認(rèn)識基因的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了可能性［13-14］。為此，在全基因組水平上對煙草GGPPS 基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)地注釋、序列分析、分子進(jìn)化分析，以期為進(jìn)一步研究和利用其功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 GGPPS 基因查找與鑒定

利用擬南芥中確定的12個(gè)GGPPS基因編碼的蛋白質(zhì)序列［15］（TAIR Release 10，http://www.arabidopsis.org/）和普通煙草中已克隆的4 個(gè)GGPPS 基因編碼的蛋白質(zhì)序列（NCBI 登錄號:ADD49734.1，ADD49735.1，AFB35651.1，AFC 88470.2），與美國Phillip Morris 公司公布的普通煙草TN90［14］、林煙草、絨毛狀煙草［13］基因組序列進(jìn)行TBLASTN比對?；诒葘Y(jié)果，利用AUGUSTUS軟件［16］進(jìn)行開放閱讀框（ORF）的預(yù)測。對于預(yù)測得到的基因，利用Pfam 數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)域注釋。然后，對每個(gè)基因進(jìn)行手工檢查，具有完整ORF 并且序列包含DD（XX）1-2D 和CXXXC 等保守基序的基因作為最終確定的GGPPS 基因。番茄、土豆、辣椒中GGPPS 基因的查找是利用擬南芥中GGPPS 基因編碼的蛋白質(zhì)序列，分別對番茄［17］（ITAG Release 2.3，http://solgenomics.net/）、土豆［18］（PGSC DM Version 3.4，http://potatogenome.net/）、辣 椒［19］（Pepper Version 1.55，http://peppergenome.snu.ac.kr/）基因集進(jìn) 行BLASTP 比對，之后的鑒定方法與煙草相同。

1.2 GGPPS 基因注釋

利 用Compute pI/Mw software［20］（http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）預(yù) 測GGPPS 基 因編碼的蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)；信號肽的預(yù)測用TargetP［21］軟 件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP）。

1.3 多序列聯(lián)配和系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MUSCLE［22］（v3.8.31）進(jìn)行多序列聯(lián)配；采用MEGA 5.2［23］進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，其方法為鄰近法（NJ），BOOTSTRAP 值為1 000。

1.4 基因復(fù)制類型確定

串聯(lián)重復(fù)基因定義為基因組上位置相鄰的基因；對于片斷重復(fù)基因，基于中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，利用MCScanX［24］對基因共線性區(qū)間進(jìn)行查找鑒定，共線性區(qū)間內(nèi)的基因?qū)σ暈槠瑪嘀貜?fù)基因。

1.5 Ka 和Ks 分析

首先利用MUSCLE（v3.8.31）將GGPPS 基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列聯(lián)配，然后編寫PERL 腳本將蛋白質(zhì)聯(lián)配結(jié)果轉(zhuǎn)換為CDS 序列聯(lián)配，基于CDS聯(lián)配結(jié)果利用KaKs_Calculator 軟件進(jìn)行非同義替換率（Ka）和同義替換率（Ks）計(jì)算［25］。按文獻(xiàn)［26］的方法計(jì)算基因進(jìn)化速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 GGPPS 基因查找與注釋

通過TBLASTN比對（期望值e≤100），基于ORF和結(jié)構(gòu)域信息，最終在普通煙草中鑒定出9 個(gè)成員（大亞基7個(gè)、小亞基2個(gè)），林煙草5個(gè)成員（大亞基4個(gè)、小亞基1個(gè)），絨毛狀煙草5個(gè)成員（大亞基4個(gè)、小亞基1 個(gè)），見表1。針對煙草中鑒定出的GGPPS基因，首先將林煙草和絨毛狀煙草的GGPPS 基因按照大小亞基分類依次進(jìn)行了編號命名，其中1～4 號為大亞基基因，5 號為小亞基基因。隨后，鑒于普通煙草為異源四倍體，其中的大多數(shù)基因包含兩個(gè)拷貝，為了方便與二倍體中的基因進(jìn)行比對，利用同源關(guān)系對普通煙草中每個(gè)GGPPS 基因及其拷貝進(jìn)行了編號命名。另外，通過對煙草近緣物種（番茄、土豆和辣椒）基因集進(jìn)行BLASTP 比對（e≤100）及篩選過濾，在番茄中鑒定出6個(gè)GGPPS基因，在土豆和辣椒中分別鑒定出8 個(gè)和4 個(gè)GGPPS 基因（表2）。因此，在數(shù)量方面，二倍體煙草與其近緣物種相差不大，較番茄、土豆分別少1 個(gè)和3 個(gè)，比辣椒多1個(gè)。與擬南芥相比，煙草及其近緣物種數(shù)量偏少。

表1 煙草GGPPS 基因編碼區(qū)所在基因組位置信息

表2 其他物種的GGPPS 基因登錄號

對煙草GGPPS 基因編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（表3）顯示，普通煙草、林煙草、絨毛狀煙草GGPPS 基因ORF 長度在999～1 119 bp 之間，編碼332～372 個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為36.2～40.7 kD，等電點(diǎn)在5.41～8.32 之間。表明普通煙草、林煙草和絨毛狀煙草GGPPS 基因分子信息數(shù)值范圍基本沒有差異。在3 種煙草中，大亞基基因之間基本保持一致，小亞基基因各項(xiàng)數(shù)值均基本小于大亞基基因。

表3 煙草GGPPS 基因編碼的蛋白質(zhì)信息

2.2 GGPPS 基因結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域分析

對普通煙草、林煙草、絨毛狀煙草GGPPS 進(jìn)行聚類及基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明:煙草GGPPS 基因家族分為小亞基［9］和大亞基［10］兩組，見圖1。在基因結(jié)構(gòu)方面（圖1），小亞基中的基因由兩個(gè)外顯子組成，大亞基的基因只包含一個(gè)外顯子，表明小亞基與大亞基在基因結(jié)構(gòu)方面有明顯差異。另外，在結(jié)構(gòu)域方面（圖2），GGPPS 家族包含之前報(bào)道的5 個(gè)保守區(qū)域，氨基酸序列中包含兩個(gè)DD（XX）1-2D（X 指任意氨基酸）天冬氨酸富集基序，此位點(diǎn)被認(rèn)為是異戊二烯基與底物相互結(jié)合的重要位點(diǎn)，小亞基在第二個(gè)天冬氨酸富集基序上發(fā)生了改變，由D 變?yōu)榱薊，即DDXXE。另外，氨基酸序列中也包含了CXXXC（X 指任意疏水性氨基酸）基序，該位點(diǎn)對亞基之間的互作非常重要，小亞基中有兩個(gè)，大亞基缺失了第二個(gè)。

2.3 GGPPS 基因組分布和基因復(fù)制分析

對GGPPS 家族成員在煙草基因組上的分布進(jìn)行了分析，結(jié)果（圖3）顯示，普通煙草中NtabGGPPS3-1 與NtabGGPPS4-1、NtabGGPPS3-2與NtabGGPPS4-2，絨毛狀煙草中NtomGGPPS3 與NtomGGPPS4，林煙草中NsylGGPPS3 與NsylGGPPS4分別位于相同的Scaffold 上，并且其位置緊密相連。因此，這些基因可能發(fā)生了串聯(lián)重復(fù)。另外，利用MCScanX 對煙草基因共線性進(jìn)行了查找鑒定，由于目前已公布的煙草基因組組裝效果不好，不能滿足基因共線性分析的要求，因而利用中國煙草基因組數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)進(jìn)行了煙草共線性分析。結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，普通煙草中NtabGGPPS1-1與NtabGGPPS3-1（或NtabGGPPS4-1）、NtabGGPPS1-2與NtabGGPPS3-2（或NtabGGPPS4-2），絨毛狀煙草中NtomGGPPS1 與NtomGGPPS3（或NtomGGPPS4），林煙草中NsylGGPPS1 與NsylGGPPS3（或NsylGGPPS4）互為共線性基因?qū)?，說明煙草GGPPS 家族可能發(fā)生了區(qū)段復(fù)制。

圖1 普通煙草、林煙草、絨毛狀煙草GGPPS 聚類及基因結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 普通煙草GGPPS 基因編碼的氨基酸序列比對

圖3 普通煙草NtabGGPPS1-1，NtabGGPPS3-1 和NtabGGPPS4-1 基因組分布示意圖

2.4 GGPPS 基因家族與其他物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果（圖4）顯示，煙草及近緣物種（番茄、土豆、辣椒）聚為兩大組，分別為大亞基和小亞基，其中大亞基組又分為4 個(gè)簇，小亞基組1 個(gè)簇。煙草、番茄、土豆、辣椒各物種內(nèi)的GGPPS基因并未按照物種聚集在一起，相反，各物種間GGPPS 直系同源基因獨(dú)立聚集成簇，這表明茄科GGPPS 家族歷史久遠(yuǎn)，其中相當(dāng)一部分成員在茄科各物種分化之前就已形成，并且在隨后的進(jìn)化過程中非常保守。另外，進(jìn)化樹顯示，林煙草、絨毛狀煙草的GGPPS 基因與番茄、土豆、辣椒中的同源基因保持了良好的對應(yīng)關(guān)系，基于簡約性（Parsimony）原則，推測番茄和土豆GGPPS 家族發(fā)生了擴(kuò)增，分別增加了1 個(gè)和3 個(gè)拷貝，辣椒中發(fā)生了丟失，缺少了1 個(gè)拷貝，而林煙草、絨毛狀煙草中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的基因獲得和基因丟失。另外，明確了普通煙草中各個(gè)GGPPS 基因的親本來源（表4）。由表4 可知，NtabGGPPS2 缺少1 個(gè)拷貝，該拷貝與絨毛狀煙草NtomGGPPS2 互為直系同源，可能發(fā)生了基因丟失。

圖4 普通煙草、林煙草、絨毛狀煙草與其他物種GGPPS 基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹

表4 普通煙草與林煙草、絨毛狀煙草GGPPS 基因直系同源對應(yīng)關(guān)系

2.5 普通煙草GGPPS 基因選擇壓分析

Ks 值計(jì)算結(jié)果（表5）顯示，其分布于0.003～0.020 之間。其中，NtabGGPPS1-1 與NsylGGPPS1、NtabGGPPS1-2 與NtomGGPPS1 兩個(gè)基因?qū)Φ腒s 值在0.020 左 右，NtabGGPPS3-2 與NtomGGPPS3、NtabGGPPS4-2 與NtomGGPPS4、NtabGGPPS5-2 與NtomGGPPS5 的Ks 值在0.003 左右。按照普通煙草形 成時(shí)間為20萬年計(jì)算［27］，NtabGGPPS1-1 和NtabGGPPS1-2 進(jìn)化速率為每個(gè)位點(diǎn)每年5×10-8替換，NtabGGPPS3-2、NtabGGPPS4-2和NtabGGPPS5-2進(jìn)化速率為每個(gè)位點(diǎn)每年8×10-9替換?？梢姡琋tabGGPPS1-1 和NtabGGPPS1-2 兩個(gè)基因進(jìn)化速率較快。為了進(jìn)一步檢測普通煙草GGPPS 基因在進(jìn)化過程中受到的選擇壓，對直系同源基因?qū)χg 的ω 值（ω=Ka/Ks）進(jìn)行了計(jì)算，結(jié)果顯示NtabGGPPS1-1 與NsylGGPPS1，NtabGGPPS1-2 與NtomGGPPS1 兩個(gè)基因?qū)@著小于1（P＜0.05），表明NtabGGPPS1-1 和NtabGGPPS1-2 基因可能受到了凈化選擇。

表5 普通煙草與林煙草、絨毛狀煙草GGPPS直系同源基因?qū)s 和ω值信息①

3 結(jié)論與討論

對煙草全基因組查找發(fā)現(xiàn)普通煙草TN90 有9個(gè)GGPPS 基因（大亞基7 個(gè)、小亞基2 個(gè)），林煙草、絨毛狀煙草各有5 個(gè)成員（大亞基4 個(gè)、小亞基1個(gè)）。基于同樣的方法對普通煙草K326 和Basma Xanthi 基因組［15］也進(jìn)行了查找，并未發(fā)現(xiàn)新的GGPPS 基因，這表明在本研究中所鑒定出的GGPPS 基因家族是完整的。在基因數(shù)量方面，二倍體煙草與近緣物種番茄（6 個(gè)）、土豆（8 個(gè)）、辣椒（4 個(gè)）差異不大，這可能是由于近緣物種中發(fā)生了基因擴(kuò)增或基因丟失造成的；而與擬南芥（12 個(gè)）相比，煙草及近緣物種數(shù)量均偏少，這可能是遠(yuǎn)緣物種間的進(jìn)化差異導(dǎo)致。煙草GGPPS 家族成員之間ORF、分子量和等電點(diǎn)很相似，小亞基基因數(shù)值總體小于大亞基基因。煙草GGPPS 基因大小亞基的基因結(jié)構(gòu)有明顯差異，大亞基基因由單個(gè)外顯子組成，小亞基基因則有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子。煙草GGPPS 基因編碼的氨基酸序列中包含了之前報(bào)道的5 個(gè)保守區(qū)域，具有天冬氨酸富集基序DD（XX）1-2D 和CXXXC 基序等重要保守區(qū)間；小亞基具有兩個(gè)CXXXC 基序，而大亞基只有一個(gè)，特別是大亞基區(qū)域存在的富含天冬氨酸的基序“DDXXD”在小亞基中變?yōu)椤癉DXXE”，這種差異可能導(dǎo)致了大亞基與小亞基之間的功能差異。

GGPPS3 與GGPPS4 屬于串聯(lián)重復(fù)，暗示GGPPS3 與GGPPS4 之間可能發(fā)生了串聯(lián)重復(fù)復(fù)制。GGPPS1 與GGPPS3 或GGPPS4為共線性基因?qū)?，暗示GGPPS1 與GGPPS3 或GGPPS4 之間可能發(fā)生了片斷復(fù)制。這表明串聯(lián)重復(fù)復(fù)制和片斷復(fù)制是煙草GGPPS 家族形成的重要機(jī)制。

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，茄科GGPPS 家族形成在茄科物種分化之前，而且隨后在各物種中進(jìn)化也比較保守。林煙草、絨毛狀煙草GGPPS 家族沒有發(fā)生明顯的基因獲得或基因丟失，但普通煙草中缺失了一個(gè)拷貝，該拷貝與絨毛狀煙草中NtomGGPPS2 相對應(yīng)；該拷貝在普通煙草K326 和Basma Xanthi 基因組中同樣是缺失的，這表明該基因在普通煙草進(jìn)化過程中可能發(fā)生了丟失。兩個(gè)基因?qū)Γ∟tabGGPPS1-1 與 NsylGGPPS1、NtabGGPPS1-2 與NtomGGPPS1）的Ks值明顯高于其他基因?qū)?，說明NtabGGPPS1-1 和NtabGGPPS1-2較其他普通煙草的GGPPS 基因進(jìn)化速率更快。兩個(gè)基因?qū)Γ∟tabGGPPS1-1 與 NsylGGPPS1、NtabGGPPS1-2 與NtomGGPPS1）的ω值顯著小于1（P＜0.05），說明NtabGGPPS1-1 和NtabGGPPS1-2 在進(jìn)化過程中可能受到了凈化選擇。

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