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        卷煙煙氣總粒相物誘導(dǎo)A549 細胞的氧化應(yīng)激研究

        2015-02-08 09:07:14張世敏謝復(fù)煒謝劍平
        煙草科技 2015年6期
        關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激煙氣劑量

        張世敏,李 翔,謝復(fù)煒,謝劍平

        中國煙草總公司鄭州煙草研究院,鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

        卷煙煙氣是一種復(fù)雜的混合物,已報道的化學(xué)成分超過8 000 種,并且部分化學(xué)成分顯示出一定的氧化性[1-4]。當(dāng)細胞或組織暴露在卷煙煙氣中時,細胞體系的氧化/抗氧化平衡被打破,細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng),并最終導(dǎo)致機體產(chǎn)生病理性損傷[5-6]。流行病學(xué)研究表明,吸煙可能與呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān),如COPD(慢性阻塞性肺?。⒎伟?、動脈硬化等[7-8]。有研究表明,吸煙導(dǎo)致這些疾病的主要機理是氧化應(yīng)激。當(dāng)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激時,細胞內(nèi)活性氧族(ROS)以及活性氮族(RON)增加,對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及DNA 等會產(chǎn)生不同程度的氧化損傷[9-11],同時激活細胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)如細胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)、還原態(tài)谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶等[12]。在這些抗氧化物中,GSH 和EC-SOD 分別在細胞內(nèi)和細胞外發(fā)揮重要的抗氧化作用[13-14]。GSH 是細胞內(nèi)含量豐富的硫醇式縮氨酸,對維持細胞氧化還原平衡發(fā)揮重要作用,被廣泛作為細胞氧化應(yīng)激標志物[12,14];EC-SOD 作為細胞抗氧化反應(yīng)的第一道防線,主要在細胞外基質(zhì)中對ROS和RON 進行首次催化分解,進而發(fā)揮重要的抗氧化作用[13,15-16]。在以往研究中,卷煙煙氣的體外毒理學(xué)評價研究主要集中在細胞毒性和遺傳毒性等方面[17-20]。有關(guān)煙氣氧化損傷的生物效應(yīng)研究也有部分報道。Tollefson 等[21]發(fā)現(xiàn)EC-SOD 對卷煙煙氣萃取物誘導(dǎo)的肺泡巨噬細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)具有明顯保護作用;米娜等[22]在研究卷煙煙氣萃取物對線粒體的氧化損傷時,檢測到卷煙煙氣萃取物染毒后的支氣管上皮細胞內(nèi)GSH 顯著降低;Kaushik 等[23]發(fā)現(xiàn)卷煙煙氣萃取物通過干擾細胞氧化還原平衡來調(diào)節(jié)細胞增殖,該過程與細胞內(nèi)還原態(tài)谷胱甘肽與氧化態(tài)谷胱甘肽比值(GSH/GSSG)的水平緊密相關(guān)。有研究表明,EC-SOD等氧化應(yīng)激指標的表達在不同暴露時間下會表現(xiàn)出一定程度的差異[1,24]。在本研究中,擬選取GSH和EC-SOD 作為卷煙煙氣誘導(dǎo)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的生物標志物,通過檢測卷煙煙氣總粒相物(TPM)在不同染毒時間下GSH/GSSG 和EC-SOD水平的變化,分別從胞內(nèi)和胞外水平研究TPM 誘導(dǎo)的細胞氧化損傷,旨在為卷煙煙氣誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激研究提供科學(xué)依據(jù)和參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑與儀器

        3R4F 參比卷煙(美國肯塔基大學(xué));人肺腺癌細胞A549(中國上海生科院細胞資源中心)。

        RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺(純度99.9%)(北京Solarbio 公司);中性紅染料(純度99.0%,美國Sigma公司);胎牛血清(生化級,美國Gibco公司);胰酶(500 U/mg,美國Amresco 公司);氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、七水合磷酸氫二鈉、無水乙醇、冰醋酸(AR,天津凱通化學(xué)試劑有限公司);二甲基亞砜(DMSO,生化級,美國Amresco 公司);GSH/GSSG ELISA 試劑盒(美國ScienCell 公司);Cu/Zn-SOD ELISA 試劑盒(美國eBioscience 公司)。

        HERA Cell 240 CO2細胞培養(yǎng)箱、HFU486 超低溫冰箱(德國Thermo 公司);Sigma 1-14 微型高速離心機、Sigma 3-18K 低溫高速離心機(德國Sigma 公司);SW-CJ-2FD 超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);SPECTRA MAX 190 酶標儀(日本Bio-Rad 公司);6 孔板、96 孔板(美國Corning Costar 公司);TH 4-200 熒光倒置顯微鏡(日本Olympus 公司);1 和5 mL 微量移液器(德國Eppendorf 公司);RM20H 轉(zhuǎn)盤型吸煙機(德國Borgwaldt KC 公司);Milli-Q 超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore 公司);TS-2 脫色搖床(北京中儀所);DQHZ-2001A 大容量全溫度搖床(江蘇太倉華美生化儀器廠)。

        1.2 方法

        1.2.1 TPM 制備

        將3R4F 參比卷煙于(22±1)℃,相對濕度(60±3)%條件下平衡48 h;按照標準(ISO 4387:2000)抽吸模式,在RM20H 轉(zhuǎn)盤型吸煙機上抽吸20 支卷煙,用92 mm 的劍橋濾片捕集TPM;將劍橋濾片置于50 mL 錐形瓶中,根據(jù)捕集的TPM 質(zhì)量,加入適量DMSO,使TPM 終濃度為10 mg/mL(母液),然后放置在搖床上于室溫下振蕩萃取20 min,過濾,分裝凍存,備用。

        1.2.2 細胞培養(yǎng)

        將A549 細胞于含10%(體積分數(shù))胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng),待細胞生長匯合度達到80%后,用0.25%(體積分數(shù))胰酶消化,離心,棄去上清液;加入新鮮的培養(yǎng)基制成細胞懸液,以1.5×104個/孔的細胞密度接種于96 孔板,于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h;移去培養(yǎng)基,實驗組分別加入10、25、50、75、100、120、140、160 和200 μg/mL TPM 溶液,陰性對照組加入20 μL/mL DMSO溶液,于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h,之后進行中性紅細胞毒性試驗。

        將A549 細胞以4.5×105個/孔的細胞密度接種于6 孔板,置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h;移去培養(yǎng)基,實驗組分別加入75 和100 μg/mL TPM 溶 液,陰性對照組加入10 μL/mL DMSO 溶液,置于37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)分別孵育4 和24 h,之后進行氧化應(yīng)激指標GSH/GSSG 和EC-SOD 的檢測。

        1.2.3 中性紅細胞毒性試驗

        移去96 孔板內(nèi)培養(yǎng)基,用PBS 洗滌;加入中性紅染液(質(zhì)量濃度50 μg/mL),于37 ℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h;移去孔內(nèi)染液,用PBS 洗滌;加入中性紅萃取液(50%乙醇,49%去離子水,1%冰醋酸),振蕩萃取20~30 min,于酶標儀540 nm 下檢測吸光度。

        1.2.4 氧化應(yīng)激指標檢測

        (1)GSH/GSSG 檢測。6 孔板內(nèi)的細胞經(jīng)75 μg/mL 或100 μg/mL TPM 染毒4 或24 h 后,收集孔內(nèi)培養(yǎng)基,離心后,取上清液,分裝并于-80 ℃凍存?zhèn)溆???變?nèi)細胞用0.25%胰酶消化,收獲細胞。參照ScienCellTMGSH/GSSG ELISA 試劑盒說明書進行操作,即:細胞經(jīng)細胞裂解液重懸,冰上放置5 min 后,于4 ℃、10 000 g 條件下離心10 min,收集上清液;將上清液分為兩份,并以50 μL/孔加入到96 孔板內(nèi),其中一份樣品孔加入1 μL 清除劑靜置1 min,用于檢測GSSG,另一份沒有添加清除劑的樣品孔用于檢測全部的GSH;所有檢測樣均加入150 μL 工作液,靜置2 min,并以50 μL/孔加入輔酶NADPH 稀釋溶液。用酶標儀在412 nm 下檢測吸光度。

        (2)EC-SOD 檢測。收集的培養(yǎng)基上清液樣品,參照Cu/Zn-SOD ELISA 試劑盒說明書進行檢測,即:將抗體包被板先用洗滌液清洗2 次,然后每孔加入100 μL 樣品,并以50 μL/孔用量加入現(xiàn)配的辣根過氧化酶同源物稀釋劑,密封后室溫下振蕩1 h;洗滌液清洗3 次,以100 μL/孔用量加入基質(zhì)溶液,室溫下避光振蕩10 min;立即以100 μL/孔用量加入終止液,并放入酶標儀中檢測450 nm 下的吸光度。

        1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

        用Origin 8.1 和SPSS 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。數(shù)據(jù)用±SD 表示,P<0.05 為顯著性差異,P<0.01 為極顯著性差異。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 TPM 與細胞存活率的劑量-效應(yīng)關(guān)系

        采用中性紅攝取試驗檢測3R4F 參比卷煙主流煙氣TPM 對A549 細胞的細胞毒性效應(yīng),共進行4 次獨立實驗,每次獨立實驗設(shè)置6 個重復(fù)。結(jié)果(圖1)顯示,隨著TPM 濃度的增加,TPM 與A549細胞存活率之間存在良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

        圖1 3R4F 參比卷煙TPM 與細胞存活率的劑量-效應(yīng)關(guān)系

        2.2 TPM 誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激

        為進一步研究由卷煙煙氣TPM 誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激,選擇細胞存活率70%以上的TPM 劑量進行染毒,即染毒劑量為75 和100 μg/mL,對應(yīng)的細胞存活率分別為(89.1±13.0)%和(74.7±15.9)%。

        2.2.1 TPM 對細胞內(nèi)GSH 代謝的影響

        分別進行了3 次獨立實驗,結(jié)果(圖2)顯示,在選定的TPM 染毒劑量(75 和100 μg/mL)下,采用相同的染毒時間,實驗組的GSH/GSSG 明顯低于陰性對照組(P<0.01)。同時,在相同的染毒劑量下,GSH/GSSG 在染毒4 與24 h 的實驗組之間不存在顯著性差異。表明在TPM 短時間染毒(4 h)和長時間染毒(24 h)下,細胞均發(fā)生了氧化應(yīng)激,與文獻研究結(jié)果相一致[1]。原因可能是細胞內(nèi)氧化性物質(zhì)的過量表達增加了GSH 氧化生成GSSG的速率,使GSH 濃度急劇降低,GSSG 不斷積累,最終導(dǎo)致GSH/GSSG 相對陰性對照組有明顯降低[14]。但Colombo 等[25]在研究煙氣對人牙齦纖維母細胞的氧化損傷時,根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果認為,煙氣暴露后GSH 的明顯減少和GSSG 的微量增加歸因于GSH 的烷基化。此外,也有文獻報道,GSH/GSSG的降低也可能與GSH 合成過程中的限速酶(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶)被氧化并導(dǎo)致GSH 合成受限制有關(guān)[26-27]。

        圖2 TPM 誘導(dǎo)的A549 細胞GSH/GSSG 變化

        2.2.2 TPM 對EC-SOD 表達的影響

        EC-SOD 是超氧化物歧化酶(SOD)在細胞外的主要存在形式,也是細胞首要的自由基清除劑。通過3 次獨立實驗對TPM 染毒A549 細胞后的EC-SOD 進行了測定,結(jié)果(圖3)顯示,在用TPM 短時間染毒(4 h)條件下,實驗組EC-SOD相對于陰性對照組沒有明顯增加。但隨著染毒時間的延長(24 h),實驗組EC-SOD 極顯著地高于陰性對照組(P<0.01),并且低劑量組(75 μg/mL)與高劑量組(100 μg/mL)也呈現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01);此外,用相同劑量的TPM 染毒時,24 h 染毒組的EC-SOD 水平也極顯著地高于4 h染毒組(P<0.01)。原因可能是卷煙煙氣誘導(dǎo)細胞SOD 表達之前,細胞本身需要產(chǎn)生大量的活性氧以及超氧陰離子,而該過程需要一定的反應(yīng)時間才能實現(xiàn),因此進行較短時間的染毒并不能明顯地觀察到EC-SOD 表達量的增加[24]。據(jù)文獻報道,卷煙煙氣首先使細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺積累,達到一定濃度后會誘導(dǎo)SOD 的表達[12,28]??梢?,外源性物質(zhì)在誘導(dǎo)EC-SOD 表達時需要一定的反應(yīng)時間。

        圖3 TPM 誘導(dǎo)的A549 細 胞EC-SOD 變化

        3 結(jié)論

        ①在TPM 分別染毒4 h 和24 h 后,A549 細 胞內(nèi)GSH/GSSG 相對陰性對照組顯著降低,且在TPM 染毒24 h 后GSH/GSSG 相對于4 h 染毒組無明顯增加,表明在本實驗條件下增加TPM 染毒時間對GSH/GSSG 無顯著性影響。②在TPM 染毒時間從4 h 增加到24 h 時,EC-SOD 顯著增加,并且隨TPM 染毒劑量的增加而增加,表明TPM 染毒時間對細胞外EC-SOD 的表達有一定的影響。

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