張世敏，李 翔，謝復(fù)煒，謝劍平

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

卷煙煙氣是一種復(fù)雜的混合物，已報道的化學(xué)成分超過8 000 種，并且部分化學(xué)成分顯示出一定的氧化性［1-4］。當(dāng)細胞或組織暴露在卷煙煙氣中時，細胞體系的氧化/抗氧化平衡被打破，細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)，并最終導(dǎo)致機體產(chǎn)生病理性損傷［5-6］。流行病學(xué)研究表明，吸煙可能與呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān)，如COPD（慢性阻塞性肺?。⒎伟?、動脈硬化等［7-8］。有研究表明，吸煙導(dǎo)致這些疾病的主要機理是氧化應(yīng)激。當(dāng)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激時，細胞內(nèi)活性氧族（ROS）以及活性氮族（RON）增加，對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及DNA 等會產(chǎn)生不同程度的氧化損傷［9-11］，同時激活細胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)如細胞外超氧化物歧化酶（EC-SOD）、還原態(tài)谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶等［12］。在這些抗氧化物中，GSH 和EC-SOD 分別在細胞內(nèi)和細胞外發(fā)揮重要的抗氧化作用［13-14］。GSH 是細胞內(nèi)含量豐富的硫醇式縮氨酸，對維持細胞氧化還原平衡發(fā)揮重要作用，被廣泛作為細胞氧化應(yīng)激標志物［12,14］；EC-SOD 作為細胞抗氧化反應(yīng)的第一道防線，主要在細胞外基質(zhì)中對ROS和RON 進行首次催化分解，進而發(fā)揮重要的抗氧化作用［13,15-16］。在以往研究中，卷煙煙氣的體外毒理學(xué)評價研究主要集中在細胞毒性和遺傳毒性等方面［17-20］。有關(guān)煙氣氧化損傷的生物效應(yīng)研究也有部分報道。Tollefson 等［21］發(fā)現(xiàn)EC-SOD 對卷煙煙氣萃取物誘導(dǎo)的肺泡巨噬細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)具有明顯保護作用；米娜等［22］在研究卷煙煙氣萃取物對線粒體的氧化損傷時，檢測到卷煙煙氣萃取物染毒后的支氣管上皮細胞內(nèi)GSH 顯著降低；Kaushik 等［23］發(fā)現(xiàn)卷煙煙氣萃取物通過干擾細胞氧化還原平衡來調(diào)節(jié)細胞增殖，該過程與細胞內(nèi)還原態(tài)谷胱甘肽與氧化態(tài)谷胱甘肽比值（GSH/GSSG）的水平緊密相關(guān)。有研究表明，EC-SOD等氧化應(yīng)激指標的表達在不同暴露時間下會表現(xiàn)出一定程度的差異［1,24］。在本研究中，擬選取GSH和EC-SOD 作為卷煙煙氣誘導(dǎo)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的生物標志物，通過檢測卷煙煙氣總粒相物（TPM）在不同染毒時間下GSH/GSSG 和EC-SOD水平的變化，分別從胞內(nèi)和胞外水平研究TPM 誘導(dǎo)的細胞氧化損傷，旨在為卷煙煙氣誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激研究提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

3R4F 參比卷煙（美國肯塔基大學(xué)）；人肺腺癌細胞A549（中國上海生科院細胞資源中心）。

RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺（純度99.9%）（北京Solarbio 公司）；中性紅染料（純度99.0%，美國Sigma公司）；胎牛血清（生化級，美國Gibco公司）；胰酶（500 U/mg，美國Amresco 公司）；氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、七水合磷酸氫二鈉、無水乙醇、冰醋酸（AR，天津凱通化學(xué)試劑有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，生化級，美國Amresco 公司）；GSH/GSSG ELISA 試劑盒（美國ScienCell 公司）；Cu/Zn-SOD ELISA 試劑盒（美國eBioscience 公司）。

HERA Cell 240 CO2細胞培養(yǎng)箱、HFU486 超低溫冰箱（德國Thermo 公司）；Sigma 1-14 微型高速離心機、Sigma 3-18K 低溫高速離心機（德國Sigma 公司）；SW-CJ-2FD 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；SPECTRA MAX 190 酶標儀（日本Bio-Rad 公司）；6 孔板、96 孔板（美國Corning Costar 公司）；TH 4-200 熒光倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；1 和5 mL 微量移液器（德國Eppendorf 公司）；RM20H 轉(zhuǎn)盤型吸煙機（德國Borgwaldt KC 公司）；Milli-Q 超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；TS-2 脫色搖床（北京中儀所）；DQHZ-2001A 大容量全溫度搖床（江蘇太倉華美生化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 TPM 制備

將3R4F 參比卷煙于（22±1）℃，相對濕度（60±3）%條件下平衡48 h；按照標準（ISO 4387:2000）抽吸模式，在RM20H 轉(zhuǎn)盤型吸煙機上抽吸20 支卷煙，用92 mm 的劍橋濾片捕集TPM；將劍橋濾片置于50 mL 錐形瓶中，根據(jù)捕集的TPM 質(zhì)量，加入適量DMSO，使TPM 終濃度為10 mg/mL（母液），然后放置在搖床上于室溫下振蕩萃取20 min，過濾，分裝凍存，備用。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

將A549 細胞于含10%（體積分數(shù)）胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞生長匯合度達到80%后，用0.25%（體積分數(shù)）胰酶消化，離心，棄去上清液；加入新鮮的培養(yǎng)基制成細胞懸液，以1.5×104個/孔的細胞密度接種于96 孔板，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h；移去培養(yǎng)基，實驗組分別加入10、25、50、75、100、120、140、160 和200 μg/mL TPM 溶液，陰性對照組加入20 μL/mL DMSO溶液，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，之后進行中性紅細胞毒性試驗。

將A549 細胞以4.5×105個/孔的細胞密度接種于6 孔板，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h；移去培養(yǎng)基，實驗組分別加入75 和100 μg/mL TPM 溶 液，陰性對照組加入10 μL/mL DMSO 溶液，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)分別孵育4 和24 h，之后進行氧化應(yīng)激指標GSH/GSSG 和EC-SOD 的檢測。

1.2.3 中性紅細胞毒性試驗

移去96 孔板內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS 洗滌；加入中性紅染液（質(zhì)量濃度50 μg/mL），于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3 h；移去孔內(nèi)染液，用PBS 洗滌；加入中性紅萃取液（50%乙醇，49%去離子水，1%冰醋酸），振蕩萃取20～30 min，于酶標儀540 nm 下檢測吸光度。

1.2.4 氧化應(yīng)激指標檢測

（1）GSH/GSSG 檢測。6 孔板內(nèi)的細胞經(jīng)75 μg/mL 或100 μg/mL TPM 染毒4 或24 h 后，收集孔內(nèi)培養(yǎng)基，離心后，取上清液，分裝并于-80 ℃凍存?zhèn)溆??？變?nèi)細胞用0.25%胰酶消化，收獲細胞。參照ScienCellTMGSH/GSSG ELISA 試劑盒說明書進行操作，即:細胞經(jīng)細胞裂解液重懸，冰上放置5 min 后，于4 ℃、10 000 g 條件下離心10 min，收集上清液；將上清液分為兩份，并以50 μL/孔加入到96 孔板內(nèi)，其中一份樣品孔加入1 μL 清除劑靜置1 min，用于檢測GSSG，另一份沒有添加清除劑的樣品孔用于檢測全部的GSH；所有檢測樣均加入150 μL 工作液，靜置2 min，并以50 μL/孔加入輔酶NADPH 稀釋溶液。用酶標儀在412 nm 下檢測吸光度。

（2）EC-SOD 檢測。收集的培養(yǎng)基上清液樣品，參照Cu/Zn-SOD ELISA 試劑盒說明書進行檢測，即:將抗體包被板先用洗滌液清洗2 次，然后每孔加入100 μL 樣品，并以50 μL/孔用量加入現(xiàn)配的辣根過氧化酶同源物稀釋劑，密封后室溫下振蕩1 h；洗滌液清洗3 次，以100 μL/孔用量加入基質(zhì)溶液，室溫下避光振蕩10 min；立即以100 μL/孔用量加入終止液，并放入酶標儀中檢測450 nm 下的吸光度。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Origin 8.1 和SPSS 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理。數(shù)據(jù)用±SD 表示，P＜0.05 為顯著性差異，P＜0.01 為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TPM 與細胞存活率的劑量-效應(yīng)關(guān)系

采用中性紅攝取試驗檢測3R4F 參比卷煙主流煙氣TPM 對A549 細胞的細胞毒性效應(yīng)，共進行4 次獨立實驗，每次獨立實驗設(shè)置6 個重復(fù)。結(jié)果（圖1）顯示，隨著TPM 濃度的增加，TPM 與A549細胞存活率之間存在良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖1 3R4F 參比卷煙TPM 與細胞存活率的劑量-效應(yīng)關(guān)系

2.2 TPM 誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激

為進一步研究由卷煙煙氣TPM 誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激，選擇細胞存活率70%以上的TPM 劑量進行染毒，即染毒劑量為75 和100 μg/mL，對應(yīng)的細胞存活率分別為（89.1±13.0）%和（74.7±15.9）%。

2.2.1 TPM 對細胞內(nèi)GSH 代謝的影響

分別進行了3 次獨立實驗，結(jié)果（圖2）顯示，在選定的TPM 染毒劑量（75 和100 μg/mL）下，采用相同的染毒時間，實驗組的GSH/GSSG 明顯低于陰性對照組（P＜0.01）。同時，在相同的染毒劑量下，GSH/GSSG 在染毒4 與24 h 的實驗組之間不存在顯著性差異。表明在TPM 短時間染毒（4 h）和長時間染毒（24 h）下，細胞均發(fā)生了氧化應(yīng)激，與文獻研究結(jié)果相一致［1］。原因可能是細胞內(nèi)氧化性物質(zhì)的過量表達增加了GSH 氧化生成GSSG的速率，使GSH 濃度急劇降低，GSSG 不斷積累，最終導(dǎo)致GSH/GSSG 相對陰性對照組有明顯降低［14］。但Colombo 等［25］在研究煙氣對人牙齦纖維母細胞的氧化損傷時，根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果認為，煙氣暴露后GSH 的明顯減少和GSSG 的微量增加歸因于GSH 的烷基化。此外，也有文獻報道，GSH/GSSG的降低也可能與GSH 合成過程中的限速酶（γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶）被氧化并導(dǎo)致GSH 合成受限制有關(guān)［26-27］。

圖2 TPM 誘導(dǎo)的A549 細胞GSH/GSSG 變化

2.2.2 TPM 對EC-SOD 表達的影響

EC-SOD 是超氧化物歧化酶（SOD）在細胞外的主要存在形式，也是細胞首要的自由基清除劑。通過3 次獨立實驗對TPM 染毒A549 細胞后的EC-SOD 進行了測定，結(jié)果（圖3）顯示，在用TPM 短時間染毒（4 h）條件下，實驗組EC-SOD相對于陰性對照組沒有明顯增加。但隨著染毒時間的延長（24 h），實驗組EC-SOD 極顯著地高于陰性對照組（P＜0.01），并且低劑量組（75 μg/mL）與高劑量組（100 μg/mL）也呈現(xiàn)極顯著性差異（P＜0.01）；此外，用相同劑量的TPM 染毒時，24 h 染毒組的EC-SOD 水平也極顯著地高于4 h染毒組（P＜0.01）。原因可能是卷煙煙氣誘導(dǎo)細胞SOD 表達之前，細胞本身需要產(chǎn)生大量的活性氧以及超氧陰離子，而該過程需要一定的反應(yīng)時間才能實現(xiàn)，因此進行較短時間的染毒并不能明顯地觀察到EC-SOD 表達量的增加［24］。據(jù)文獻報道，卷煙煙氣首先使細胞內(nèi)神經(jīng)酰胺積累，達到一定濃度后會誘導(dǎo)SOD 的表達［12,28］?？梢?，外源性物質(zhì)在誘導(dǎo)EC-SOD 表達時需要一定的反應(yīng)時間。

圖3 TPM 誘導(dǎo)的A549 細 胞EC-SOD 變化

3 結(jié)論

①在TPM 分別染毒4 h 和24 h 后，A549 細 胞內(nèi)GSH/GSSG 相對陰性對照組顯著降低，且在TPM 染毒24 h 后GSH/GSSG 相對于4 h 染毒組無明顯增加，表明在本實驗條件下增加TPM 染毒時間對GSH/GSSG 無顯著性影響。②在TPM 染毒時間從4 h 增加到24 h 時，EC-SOD 顯著增加，并且隨TPM 染毒劑量的增加而增加，表明TPM 染毒時間對細胞外EC-SOD 的表達有一定的影響。

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