武偉 周洪偉 李國蘭 何樺波

miRNA-133b在胃癌組織中的表達及臨床意義

武偉 周洪偉 李國蘭 何樺波

目的 分析miRNA-133b表達水平的改變與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系，探討miRNA-133b在胃組織中表達的意義。方法 選擇手術(shù)治療的胃癌患者腫瘤組織63例為研究對象，取切緣正常胃黏膜為對照，設(shè)計針對miRNA-133b的特異性引物，應(yīng)用定量PCR方法檢測胃癌組織中miRNA-133b表達水平的變化。結(jié)合臨床病理資料對miRNA-133b的表達水平與腫瘤病理類型及臨床病理分期之間的關(guān)系進行分析。檢測胃癌細胞株中miRNA-133b的表達水平變化。結(jié)果 miRNA-133b在胃癌組織中表達水平明顯低于正常胃黏膜組織[ΔCt：（-6.94±3.319）vs（-4.98±2.846），P＜0.001]。其中45例miRNA-133b下調(diào)≥2.0倍，占71%；6例上調(diào)≥2.0倍，占10%；12例無明顯變化，占19%。miRNA-133b與腫瘤病理類型、腫瘤TNM分期無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。與正常胃黏膜細胞相比，在胃癌細胞株中miRNA-133b表達明顯下調(diào)（P＜0.05）。 結(jié)論 在胃癌組織及胃癌細胞中，miRNA-133b的表達水平均有不同程度的降低，但其下降程度和比例與臨床特征無明顯相關(guān)性。miRNA-133b的表達水平下調(diào)可能與促進腫瘤細胞增殖有關(guān)。

miRNA-133b 胃癌 定量PCR

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，全球每年胃癌新發(fā)病例近百萬，我國每年新發(fā)現(xiàn)40萬胃癌患者，占世界胃癌發(fā)病人數(shù)的42%[1]。探討胃癌的發(fā)病機制對胃癌的早期診斷和治療至關(guān)重要。近年來，有研究證實了微小RNA（miRNA）在胃癌研究中的重要作用，miRNA是一種內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA，長度約為16～28nt。miRNA在各種生長分化及生理過程中都有廣泛的影響，參與基因組的穩(wěn)定及后天修飾，調(diào)節(jié)新陳代謝及腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[2]，目前已有研究表明miRNAs如 miRNA-21、miRNA-27a、miRNA-451、miRNA-143及miRNA-145等在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[3-6]，另外參考胃癌臨床樣本miRNA表達譜芯片檢測結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)miRNA-133b在胃癌中表達明顯下調(diào)[7]。本研究旨在觀察miRNA-133b在胃癌組織和細胞中的表達及其在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控作用，以加深對胃癌生物學(xué)特點的認識，探尋胃癌預(yù)防和治療的新靶點。

1 資料和方法

1．1 一般資料 經(jīng)杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者本人或家屬簽署知情同意書，收集我院普外科2012年6月至2014年6月期間經(jīng)胃癌根治術(shù)獲得的新鮮標(biāo)本共63例，經(jīng)病理學(xué)診斷證實所得標(biāo)本為胃癌組織。所有患者在手術(shù)前均未行放射治療、化學(xué)治療等，此次是首次進行胃癌根治術(shù)。按美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）胃癌TNM分期（2010年第7版）標(biāo)準(zhǔn)分期將胃癌組織分為為Ⅱ期（13例），Ⅲ期（40例），Ⅳ期（10例）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及保存 腫瘤標(biāo)本取自腫瘤部位，陰性對照標(biāo)本取自距離腫瘤外緣5cm以外的正常胃黏膜組織。所有標(biāo)本取下后立即放入液氮中，隨后放在-80℃冰箱中保存。胃上皮細胞株GES-1和胃癌上皮細胞株AGS、BGC-823、HGC-27、MKN-28和MKN-45由本實驗室凍存，采用DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 總RNA提純 按Trizol試劑說明書，采用Trizol一步法提取組織和細胞中總RNA，使用ND-1000紫外/可見光分光光度計進行RNA質(zhì)量和濃度鑒定。用瓊脂電泳驗證RNA的完整性。提取的RNA分裝保存于-80℃超低溫冰箱或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。

1.2.3 實時定量PCR檢測 以U6基因作內(nèi)參，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)嚴格按照試劑盒說明書操作使用。實時熒光定量PCR儀（Rotor-Gene 3000，Corbett Research，AUS）和PCRmix試劑盒（QPK-201，TOYOBO）檢測目的基因的表達水平。目的基因ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因的Ct值。引物序列見表1。

表1 miRNA-133b和U6的逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增引物序列

1.3 miRNA-133b表達水平與臨床資料的相關(guān)分析 收集63例胃癌患者的基本人口學(xué)資料和相關(guān)臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤大小、病理分型、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。根據(jù)以上資料對病例進行分組，比較miRNA-133b相對表達倍數(shù)在不同組間的差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以或中位數(shù)表示，兩組間比較采用t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或Friedman M檢驗。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-133b在人胃癌組織中及胃癌細胞株內(nèi)表達明顯降低 miRNA-133b在多數(shù)胃癌組織中表達水平明顯低于癌旁組織[ΔCt：（-6.94±3.319）vs（-4.98±2.846），P＜0.001]。其中45例miRNA-133b下調(diào)≥2.0倍，占71%；6例上調(diào)≥2.0倍，占10%；12例無明顯變化，占19%。此外，分別培養(yǎng)胃癌細胞株和正常胃黏膜細胞，并提取RNA，定量PCR檢測miRNA-133b的表達水平，結(jié)果顯示，miRNA-133b在胃癌細胞株內(nèi)表達水平較胃正常上皮細胞內(nèi)亦明顯下降。在5個細胞株之間，BGC-823細胞中miRNA-133b表達水平最低，較GES-1細胞下降77．0%，AGS、HGC-27、MKN-28和MKN-45細胞中miRNA-133b表達水平與GES-1細胞比較，分別下降71.5%、68．3%、64．7%和50.8%（圖1），該結(jié)果與胃癌組織標(biāo)本中的檢測結(jié)果一致，提示miRNA-133b表達水平與胃癌發(fā)生有緊密聯(lián)系，miRNA-133b可能在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。

圖1 胃癌細胞株中miR-133b表達水平分析

2．2 miRNA-133b表達水平與臨床資料的相關(guān)分析 63例胃癌患者中，與Ⅱ期胃癌相比，miRNA-133b表達水平在Ⅲ、Ⅳ期胃癌中也有較明顯的下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，其他特征如年齡、性別、腫瘤大小及病理分型等因素與miRNA-133b的表達水平無關(guān)（均P＞0．05），見表2。

3 討論

miRNA-133家族包括miRNA-133a和miRNA-133b兩個成員，miRNA-133a在基因組定位于第18號染色體，而miRNA-133b則定位于第6號染色體。PrimiRNA-133b是一個由119個堿基組成的發(fā)夾狀前體，經(jīng)過Drosha和Dicer酶的剪切，最終變成22nt成熟的miRNA。既往研究提示，miRNA-133a和miRNA-133b在小鼠肌肉發(fā)育過程中的表達水平明顯升高，并且可促進其分化成熟[8]，被認為是“肌肉組織特定的miRNA”。然而新近的研究顯示，miRNA-133b在正常人體組織中同樣表達，而正常組織變成惡性腫瘤組織時，其表達水平又發(fā)生明顯的改變。如在舌癌、膀胱癌、口腔上皮癌、肺癌、食管癌等[9-14]，miRNA-133b表達水平明顯發(fā)生改變，并能影響腫瘤細胞的增殖。本研究中，我們在體內(nèi)和體外水平對63例胃癌中心組織及配對癌旁正常組織和多個胃癌細胞株中的miRNA-133b進行相關(guān)檢測，發(fā)現(xiàn)多數(shù)胃癌組織中miRNA-133b的表達水平低于癌旁組織。另外，我們檢測了miRNA-133b在胃癌上皮細胞株AGS、BGC-823、HGC-27、MKN-28和MKN-45中的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常黏膜細胞株GES-1相比，miRNA-133b在胃癌細胞株表達水平也明顯下調(diào)。因此，基于以上實驗結(jié)果，說明無論在組織水平還是細胞水平，miRNA-133b的下調(diào)表達是一個普遍現(xiàn)象。

表2 胃癌病例臨床特征與miR-133b表達水平的相關(guān)分析

進一步分析miRNA-133b的表達與胃癌的臨床病理因素的相關(guān)性顯示，miRNA-133b的表達與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小及胃癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期均無明顯統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。因此在臨床胃癌中，miRNA-133b表達水平下降的程度不能反應(yīng)腫瘤的生物學(xué)行為，它不是一個理想的早期診斷及預(yù)測轉(zhuǎn)移潛能的指標(biāo)。然而由于本實驗所用標(biāo)本是近1~3年的手術(shù)切除標(biāo)本，還缺乏長期跟蹤隨訪的研究資料，因此我們尚不能確定miRNA-133b是否與腫瘤患者的預(yù)后相關(guān)。

本研究表明，miRNA-133b在胃癌組織及細胞中的表達普遍下調(diào)，由此可認為miRNA-133b在抑制胃癌發(fā)生、發(fā)展的某個或某些環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要作用；而在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的具體作用機制有待進一步研究闡述。

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Expression of miRNA-133b in gastric cancer and its clinical significance

WUWei，ZHOU Hongwei，LI Guolan，et al.Department of General Surgery，Affiliated Hospital,Hangzhou Normal University，Hangzhou 300015,China

miRNA-133b Gastric cance Quantitative real-time PCR

2015-05-26）

（本文編輯：嚴瑋雯）

310015杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院普外科

【 Abstract】 Objective To investigate the exp ression of miR-133b in gastric cancer and its c linicopathological significance. Methods Sixty three specimens of p rimary gastric cancer and corresponding pericancerous gastric tissue were collected.The level of miRNA-133b was exam ined using quantitative real-time PCR assay(qPCR);the correlation between miRNA-133b level and c linicopathologic features were analyzed.The exp ression ofmiR-133b in 5 human gastric cancer cell lines was also exam ined by qPCR.Results Themean exp ression levelofmiRNA-133b was down-regulated in gastric cancer tissues compared with the ad jacent tissues[ΔCt:(-6.94±3.319)vs(-4.98±2.846),P＜0.001].Among 63 pairs gastric cancer tissues,45 cases showed down-regulation of miRNA-133b＞2 folds,12 cases had no d ifference,6 cases d isp layed up-regulation＞2 folds.No significantassociations were detected between the levelofmiRNA-133b exp ression and TNM stage in gastric cancer(P＞0.05).miRNA-133b was also marked ly down-regulated in gastric cancer cell lines. Conclusion miRNA-133b exp ression is down-regulated in gastric cancer tissue and human gastric cell lines.There is no association of miRNA-133b exp ression w ith TNM staging.