何藝 徐群紅 陳雪琴 王鳴 費曉 趙寧 王本勇 謝祥成 邱冬豪

貝伐珠單抗對小鼠腎臟損害作用及機制研究

何藝 徐群紅 陳雪琴 王鳴 費曉 趙寧 王本勇 謝祥成 邱冬豪

目的 了解貝伐珠單抗及不同劑量鼠源貝伐珠單抗對小鼠腎臟的損害作用并探討其機制。方法 將42只C57BL/6小鼠隨機分為對照組（12只）及貝伐珠單抗組、低劑量鼠源貝伐珠單抗組、高劑量鼠源貝伐珠單抗組（各10只）。4周后處死小鼠，收集尿液、血清，檢測尿微量白蛋白（MA）、血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C（Cys-C）、血尿素氮（BUN）及血肌酐（Cr）；取腎臟組織，HE染色后光鏡觀察腎臟組織結(jié)構(gòu)，免疫熒光染色觀察免疫復(fù)合物IgM、IgG、IgA沉積，免疫組化染色觀察IgM、IgG、IgA、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及Nephrin表達，電鏡觀察腎臟組織超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 貝伐珠單抗組、低劑量鼠源貝伐珠單抗組及高劑量鼠源貝伐珠單抗組尿MA、血清Cys-c水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。貝伐珠單抗組和高劑量鼠源貝伐珠單抗組血清BUN、Cr水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。高劑量鼠源貝伐珠單抗組血清BUN及Cr水平與貝伐珠單抗組、低劑量鼠源貝伐珠單抗組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。貝伐珠單抗組免疫熒光IgG+～++；高劑量鼠源貝伐珠單抗組免疫熒光IgM++，免疫組化VEGF表達下調(diào)，電鏡見腎小球足細胞足突融合。 結(jié)論 貝伐珠單抗引起腎臟損害的機制可能是下調(diào)VEGF的表達，引起免疫復(fù)合物沉積，導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細胞足突融合，損害腎小球濾過膜，最終導(dǎo)致蛋白尿的形成及腎功能的損害。

貝伐珠單抗 腎臟損害 蛋白尿 腎臟病理

新型靶向藥物貝伐珠單抗是Genentech公司開發(fā)的一種重組人源化單克隆抗體，自從美國FDA于2004年2月26日批準用于臨床以來，國內(nèi)外眾多臨床研究已顯示，貝伐珠單抗臨床使用安全性良好，主要不良反應(yīng)為腎臟損害、高血壓和出血，其中腎臟損害主要表現(xiàn)為蛋白尿，輕度蛋白尿發(fā)生率21%～63%，盡管發(fā)病率很高，大多數(shù)患者癥狀不嚴重，蛋白尿＞3.5g/d約占6.5%，且蛋白尿可能與貝伐珠單抗呈劑量依賴性[1]。但它所引起蛋白尿等腎臟損害的機制、不同劑量引起腎臟損害的嚴重程度、早期檢測方法及有效、安全的干預(yù)手段等，均還缺乏進一步的系統(tǒng)研究。本研究以C57BL/6小鼠為對象，觀察貝伐珠單抗及不同劑量鼠源貝伐珠單抗對腎功能的損害作用，分析其引起腎臟損害的初步機制，為臨床安全使用貝伐珠單抗提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 C57BL/6小鼠42只（上海斯萊克實驗動物有限公司），月齡6~8個月，體重l8～22g。貝伐珠單抗購自羅氏公司；鼠源貝伐珠單抗（Recombinant Mouse VEGF）購自美國ebioscience公司；兔抗鼠VEGF抗體購自美國ebioscience公司；兔抗鼠Nephrin抗體購自美國ebioscience公司；DAB顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；FITC標記兔抗小鼠抗體購自美國Sigma公司；760型全自動生化分析儀購自日本日立公司；OLYMPUSBX51lF320H1型光學(xué)顯微鏡、JEM-1230型透射電子顯微鏡購自日本電子株式會社；LKB-NOVA型超薄切片機購自瑞典LKB公司；低溫高速離心機購自德國Heraeus公司。

1.2 方法 將小鼠隨機分為4組，對照組12只，其余每組10只。對照組：給予0.9%氯化鈉注射液10mg/kg尾靜脈給藥，5次/周；貝伐珠單抗組：給予5mg/kg尾靜脈給藥，5次/周；低劑量鼠源貝伐珠單抗組：給予2.5mg/ kg尾靜脈給藥，5次/周；高劑量鼠源貝伐珠單抗組：給予5mg/kg尾靜脈給藥，5次/周。4周后使用頸椎脫臼法處死小鼠，抽取血液280μl，膀胱穿刺法收集尿液500μl，并取腎臟組織，用于制作冷凍切片、石蠟切片和電鏡標本。采用雙縮脲法檢測小鼠尿微白蛋白（MA），HcY循環(huán)酶法檢測半胱氨酸蛋白酶抑制劑C（Cys-C），全自動生化分析檢測血尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr）。

1.3 光鏡觀察腎臟組織病理學(xué)改變 冷凍切片的標本在4%多聚甲醛中固定1h，接著用PBS液洗6次×30min，然后用25%蔗糖水脫水過夜，次日用冷凍切片包埋劑OCT包埋劑包埋、切片，并在-20℃中保存。用于石蠟切片的標本在甲醛中固定48h以上，再洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，最后在二甲苯里脫蠟，并于室溫保存。光鏡觀察腎臟組織病理學(xué)改變。

1.4 免疫熒光染色觀察免疫復(fù)合物沉積 將冷凍切片的標本從-20℃取出，平放在濕盒中晾干，1×PBS液洗3次×5min，封閉液（1×PBS+5%羊血清+0.3%Triton-100）封閉1h，加一抗（IgM抗體、IgG抗體及IgA抗體，1∶500，用封閉液稀釋）4℃孵育過夜，1×PBS液洗3次×5min，加二抗（cy2、cy3熒光染料，1∶1 000，用封閉液稀釋）室溫孵育1h，DAPI（1∶5 000，用1×PBS液稀釋）室溫染細胞核5min，1×PBS液洗3次×5min，加抗淬滅劑封片。采用熒光顯微鏡觀察并記錄結(jié)果，根據(jù)顯現(xiàn)的熒光強度來判斷免疫復(fù)合物的多少：陰性；高倍鏡下似乎可見為±；低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下明顯可見為+；低倍鏡下明顯可見，高倍鏡下清晰可見為++；低倍鏡下清晰可見，高倍鏡下耀眼為+++；低倍鏡下耀眼，高倍鏡下刺眼為++++。

1.5 免疫組化染色觀察免疫復(fù)合物、VEGF及Nephrin的表達 將石蠟切片的標本用微波法修復(fù)抗原（抗原修復(fù)液為檸檬酸鹽緩沖液），每次中火5min，重復(fù)3遍。待冷卻至室溫后采用3%雙氧水處理10min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，1×PBS液洗3次×5min，封閉采用正常山羊血清工作液室溫孵育20min，加一抗（IgM抗體、IgG抗體、IgA抗體、VEGF抗體及Nephrin抗體）4℃過夜，1×PBS液洗3次×5min，加通用型生物素化二抗工作液室溫孵育30min，1×PBS液洗3次×5min，HPR標記鏈親和素工作液室溫孵育30min，1×PBS液洗3次×5min，DAB顯色3~5min，并用自來水終止顯色。蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，脫水，透明，封片，鏡檢。

1.6 透射電鏡觀察腎臟組織超微結(jié)構(gòu) 用于電鏡觀察的腎臟組織標本在2.5%戊二醛中固定3d，用1×PBS液洗2次×15min，再用1%鋨酸固定2h，用1×PBS液清洗2遍，然后用丙酮梯度脫水，最后用OCT包埋劑進行浸透和包埋，切片。在透射電子顯微鏡下觀察各組大鼠腎臟組織超微結(jié)構(gòu)并記錄。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠尿MA和血清Cys-C、BUN、Cr水平的比較 見表1。

由表1可見，貝伐珠單抗組、低劑量鼠源貝伐珠單抗組及高劑量鼠源貝伐珠單抗組尿MA水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且尿MA水平隨鼠源貝伐珠單抗的劑量增加呈上升趨勢。貝伐珠單抗組、低劑量鼠源貝伐珠單抗組及高劑量鼠源貝伐珠單抗組血清Cys-c水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），且血清Cys-c水平隨鼠源貝伐珠單抗的劑量增加呈上升趨勢。貝伐珠單抗組及高劑量鼠源貝伐珠單抗組血清BUN、Cr水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。高劑量鼠源貝伐珠單抗組血清BUN、Cr水平與貝伐珠單抗組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。高劑量鼠源貝伐珠單抗組血清BUN、Cr水平與低劑量鼠源貝伐珠單抗組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 各組小鼠尿MA和血清Cys-C、BUN、Cr水平的比較

2.2 病理檢查結(jié)果

2.2.1 光鏡所見 各組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，系膜區(qū)無明顯增寬，系膜細胞及上皮細胞無明顯增生，外周袢開放良好，詳見圖1（見插頁）。

2.2.2 熒光顯微鏡所見 IgM抗體免疫熒光顯示高劑量鼠源貝伐珠單抗組++，腎小球系膜區(qū)IgM成顆粒樣分布，其他組未見免疫復(fù)合物沉積（圖2，見插頁）；IgG抗體免疫熒光顯示貝伐珠單抗組+~++，其他組未見免疫復(fù)合物沉積（圖3，見插頁）；IgA抗體免疫熒光未見明顯顯像，提示無明顯免疫復(fù)合物沉積（圖4，見插頁）。

2.2.3 免疫組化檢測IgM、IgG及IgA 各組免疫組化無明顯顯像，IgM、IgG、IgA在系膜區(qū)、血管袢內(nèi)外側(cè)均未見明顯沉積，詳見圖5-7（見插頁）。

2.2.4 免疫組化檢測VEGF表達 VEGF陽性細胞胞質(zhì)染色為棕黃色，對照組、貝伐珠單抗組及低劑量鼠源貝伐珠單抗組均有棕黃色染色，而高劑量鼠源貝伐珠單抗組未見明顯染色，表明VEGF的表達被抑制，提示高劑量鼠源貝伐珠單抗下調(diào)了VEGF的表達，詳見圖8（見插頁）。

2.2.5 免疫組化檢測Nephrin表達 Nephrin陽性細胞胞質(zhì)染色為棕色，4組均呈現(xiàn)棕色（圖9，見插頁）。對Nephrin的免疫組化結(jié)果進行定量分析和統(tǒng)計，各組間的Nephrin表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），各劑量鼠源貝伐珠單抗均未影響Nephrin的表達，詳見圖10（見插頁）。

2.2.6 電鏡檢查 高劑量鼠源貝伐珠單抗組可見足突廣泛融合，各組中均無明顯腎小球基底膜增厚，未見系膜基質(zhì)增寬，無明顯電子致密斑沉積的顯像（圖11，見插頁），提示高劑量鼠源貝伐珠單抗通過對足細胞的損害可導(dǎo)致腎臟濾過膜的破壞。

3 討論

貝伐珠單抗是一個針對VEGF靶點、作用機制相對明確的單克隆IgG抗體藥物，由93%的人IgG1框架區(qū)和7%的鼠源性抗原結(jié)合互補決定區(qū)組成，可以與循環(huán)中VEGF的所有異構(gòu)體發(fā)生競爭性高親和力結(jié)合，阻止其與內(nèi)皮細胞表面相應(yīng)的VEGF受體結(jié)合，使受體無法活化，抑制內(nèi)皮細胞有絲分裂，減少新生血管生成，從而阻止腫瘤細胞生長所需的血液、氧氣和其它營養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤的生長[2]。臨床試驗已證明，貝伐珠單抗聯(lián)合化療對轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌[3]、非小細胞肺癌[4]、轉(zhuǎn)移性腎癌[5]及膠質(zhì)母細胞瘤[6]等多種實體瘤有確切的療效，并延長患者的無進展生存期和總生存期。國內(nèi)外眾多研究顯示，其主要不良反應(yīng)為腎臟損害、高血壓和出血，其中腎臟損害主要表現(xiàn)為蛋白尿。

在腎臟中，腎小球足細胞和腎小管上皮細胞VEGF的表達最為突出[7]，由腎小球臟層上皮細胞及遠端集合管上皮細胞合成與分泌，尤其是近髓及髓放線處的腎小球足突細胞及小管上皮細胞。而VEGF受體主要分布在入球小動脈、腎小球和腎小管周圍血管內(nèi)皮細胞。腎單位逐漸減少的過程中，適量的VEGF可以促使腎小球和腎小管增生、肥大，進而維持腎小球結(jié)構(gòu)和功能完整，具有保護腎功能的作用[8]。長期使用貝伐珠單抗可與VEGF結(jié)合，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷而出現(xiàn)腎臟損害，表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞孔徑擴大，血漿蛋白滲入皮下，導(dǎo)致殘余腎臟的腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)展。

貝伐珠單抗在臨床使用過程中引起腎臟損害、蛋白尿的主要機制為各種原因引起的足細胞或內(nèi)皮細胞的損傷、內(nèi)皮細胞表面多糖蛋白復(fù)合物的減少、VEGF的調(diào)節(jié)失衡等，可能的原因有：（1）貝伐珠單抗可能抑制足細胞VEGF的表達，下調(diào)足細胞裂孔隔膜膜蛋白Nephrin表達，引起腎小球內(nèi)皮細胞肥大、脫落，從而引起多種腎小球、腎小管病變，導(dǎo)致腎小球濾過膜通透性增高，腎小球濾液中的蛋白質(zhì)增多，超過了腎小管的重吸收能力時，最終導(dǎo)致蛋白尿的形成，嚴重者可引起腎病綜合征[9]。（2）貝伐珠單抗可導(dǎo)致繼發(fā)性高血壓[10]，引起腎小球內(nèi)壓增加，從而造成腎損傷。Teramachi等[10]對2010年2月至2011年2月期間接受貝伐珠單抗聯(lián)合化療的47例患者進行分析，表明收縮壓（≥130mmHg）是貝伐珠單抗聯(lián)合化療導(dǎo)致蛋白尿的危險因素。（3）貝伐珠單抗可引起亞急性腎小球血栓性微血管病[11]。近期Izzedine等[12]隨訪了29例接受以VEGF為靶點的抗腫瘤治療后，逐漸出現(xiàn)蛋白尿、高血壓和（或）腎功能不全的患者，其中21例患者腎活檢結(jié)果異常，血栓性微血管病占61.9%，相關(guān)腎小球中幾乎檢測不到VEGF水平。

尿MA是常規(guī)腎功能檢查，可用于評價腎小球及近端腎小管功能。血清Cys-C水平已成為評估腎小球濾過率優(yōu)于血肌酐的敏感指標[13]。本研究顯示各實驗組均可引起小鼠尿MA、血清Cys-C水平增高，提示尿MA、血清Cys-C可較敏感的反映腎臟功能的損害，且高劑量鼠源貝伐珠單抗組所引起小鼠尿MA、血清Cys-C水平較低劑量鼠源貝伐珠單抗組更明顯，提示鼠源貝伐珠單抗對腎臟的損害呈現(xiàn)劑量依賴性。貝伐珠單抗組及高劑量鼠源貝伐珠單抗組可進一步引起血清BUN、Cr水平升高，也提示血清BUN、Cr水平的敏感性稍差。此外，本實驗研究對象為C57BL/6小鼠，貝伐珠單抗為重組人源化單克隆抗體，由93%的人IgG1框架區(qū)和7%的鼠源性抗原結(jié)合互補決定區(qū)組成，鼠源性貝伐珠單抗較其更具有種族優(yōu)勢，對小鼠腎臟的損害相對更明顯。

本研究發(fā)現(xiàn)高劑量鼠源貝伐珠單抗組較其他組VEGF棕色染色較輕，提示高劑量鼠源貝伐珠單抗下調(diào)了VEGF的表達，考慮高劑量鼠源貝伐珠單抗與小鼠體內(nèi)VEGF結(jié)合，導(dǎo)致了VEGF表達減少；而Nephrin在各組間未見明顯的差異，可能與此次實驗用藥時間較短、劑量不足相關(guān)，故而在VEGF下游的Nephrin表達未受到影響。通過本研究可以證明貝伐珠單抗通過減少VEGF的表達造成腎臟濾過膜破壞，從而造成腎小球功能損傷。此外，免疫熒光染色顯示高劑量鼠源貝伐珠單抗組免疫復(fù)合物IgM沉積較其他組明顯，同時IgG抗體免疫熒光顯示貝伐珠單抗組+~++，由此提示貝伐珠單抗導(dǎo)致的尿蛋白與免疫復(fù)合物沉積有關(guān)。

貝伐珠單抗及各劑量鼠源貝伐珠單抗組均未引起小鼠HE染色組織病理學(xué)的改變，僅電鏡觀察到高劑量鼠源貝伐珠單抗組腎小球內(nèi)皮細胞足突融合，一方面考慮貝伐珠單抗的腎臟損傷作用可能為一過性，未造成永久性的病理改變；另一方面，可能與貝伐珠單抗用藥時間不夠長、用藥劑量不夠大有關(guān)。若進一步研究貝伐珠單抗所致腎臟損害的分子機制，需要建立更為理想的實驗?zāi)Ｐ?，國外研究提示轉(zhuǎn)基因小鼠可能較為理想，但是受動物實驗條件和實驗費用限制，目前國內(nèi)尚未建立此模型。

目前臨床上應(yīng)用抗VEGF靶向治療的大多為晚期惡性腫瘤患者，需長程單一使用貝伐珠單抗，或聯(lián)合順鉑等化療藥物同時使用。早期識別貝伐珠單抗等抗VEGF藥物的并發(fā)癥可以允許醫(yī)師及時地調(diào)整藥物劑量、積極干預(yù)，從而進行序貫治療，使患者獲得最大益處。基于本實驗，筆者建議在臨床上可以將尿MA、血清Cys-C作為早期監(jiān)測指標，聯(lián)合血清BUN、Cr的檢測，并密切隨訪血壓，及時發(fā)現(xiàn)貝伐珠單抗引起腎臟的早期損害，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師及時調(diào)整用藥方案、盡早積極干預(yù)。對于有腎臟疾病史及尿蛋白陽性的患者，當尿蛋白+++或24h尿蛋白＞3.5g時需要請腎臟?？漆t(yī)師會診，必要時考慮永久停藥。

綜上所述，本研究顯示貝伐珠單抗引起腎臟損害的機制可能是下調(diào)VEGF的表達、引起免疫復(fù)合物沉積、導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細胞足突融合，進一步損害腎小球濾過膜，最終導(dǎo)致蛋白尿的形成及腎功能的損害，初步證實了貝伐珠單抗對小鼠腎臟功能的損害及其機制。

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Bevacizumab-induced renal impairment in mice and its mechanism

HE Yi,XU Qunhong,CHEN Xueqin,et al.Department of Nephrology,Hangzhou Geriatric Hospital,Hangzhou 310022,China

Bevacizumab Renal impairment Proteinuria Renalpathology

2015-07-19）

（本文編輯：嚴瑋雯）

杭州市衛(wèi)生科技計劃（2011Z002）；吳階平醫(yī)學(xué)基金會臨床科研專項資助基金（320.6750.12364）

310022杭州市老年病醫(yī)院內(nèi)科（何藝）；杭州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科（徐群紅、王鳴、費曉、趙寧、王本勇、謝祥成、邱冬豪），腫瘤內(nèi)科（陳雪琴）

徐群紅，E-mail：helloxqh@sina.com

【 Abstract】 Objective To investigate bevacizumab-induced renal impairment in mice and its mechanism. Methods Forty two C57BL/6mice were randomly divided into 4 groups:control group(n=12),bevacizumab group(n=10),low-dosemurine bevacizumab group(n=10),high-dosemurine bevacizumab group(n=10).The animals were sacrificed 4 weeks after treatment, and urine,serum and renal tissue samples were collected.The urinary micro-albumin (MA),serum cystatin C (Cys-C),blood urea nitrogen(BUN)and creatinine(Cr)were measured.Renal morphological changes and ultrastructural changes were observed by HE staining-light microscopy and electron microscope,respectively.Immune complexes IgG/IgA/IgM deposition in renal tissue was detected with immunofluorescence and immunohistochemisty,the expression of VEGF and nephrin in renal tissue was examined by immunohistochemisty. Results Compared with control group，the levels of urinary MA and serum cys-C were significantly increased in bevacizumab group,low-dose and high-dose murine bevacizumab groups(P＜0.05).Compared with control group，the levels of serum BUN and Cr were significantly increased in bevacizumab group and high-dose murine bevacizumab group(P＜0.05).The serumlevels of BUN and Cr in high-dose murine bevacizumab group were remarkably higher than that in bevacizumab group and low-dose murine bevacizumab group(P＜0.05).Pathological results showed that the immune complexes IgG deposition in bevacizumab group showed+～ ++in immunofluorescence staining.High-dose murine bevacizumab group immunofluorescence IgM deposition ++ and the expression of VEGF was decreased in immunohistochemistry.Meanwhile electron microscopy showed that foot processes of glomerular podocytes were significantly fused in high-dose murine bevacizumab group. Conclusion Bevacizamab-induced renal impairment is associated with down-regulation of VEGF expression and immune complexes deposition,which may lead to the podocytes foot processes fusion and renal function impairment.