周文靜 馮穎 沈蓉蓉 費小陽

控制性超排卵對胚胎植入前小鼠子宮內膜蛋白質表達的影響

周文靜 馮穎 沈蓉蓉 費小陽

目的 研究控制性超排卵（COH）對胚胎植入前小鼠子宮內膜蛋白質表達的影響，探討體外受精-胚胎移植時子宮內膜容受性的生物學標志物。方法 將12只ICR雌性小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組6只。實驗組采取促排卵措施，對照組未作任何處理。通過雙向電泳和質譜分析技術研究COH對小鼠子宮內膜蛋白表達的影響。結果 實驗組蛋白電泳圖譜與對照組有明顯差異，2倍以上差異表達蛋白總數為89個。截取其中16個蛋白質點進行了質譜分析，檢測出9種有意義的差異表達蛋白。結論 COH可導致子宮內膜多種蛋白質表達改變，通過篩選子宮內膜容受性的生物學標志物，可以為提高COH周期的胚胎種植率和妊娠率提供理論依據。

胚胎植入 控制性超排卵 子宮內膜 小鼠

子宮內膜容受性是決定胚胎著床的關鍵因素?？刂菩猿怕眩╟ontrolled ovarian hyperstimulation，COH）周期是使用大量促性腺激素，引起多個卵泡同時發(fā)育，使機體出現雌激素水平異常升高以及雌孕激素比例失調。這些激素水平的改變可能影響子宮內膜對胚胎的容受性，最終導致妊娠失敗。這可能是由于子宮內膜中一些基因發(fā)生差異表達，從而導致激素、細胞因子、黏附分子及糖蛋白等多種蛋白分子的表達發(fā)生顯著性改變[1-2]。為了解自然狀態(tài)與超排卵狀態(tài)下胚胎植入前小鼠子宮內膜的蛋白質差異及可能導致的妊娠結局，本研究采用蛋白質組學研究方法，應用雙向電泳、免疫印跡和質譜分析技術分析兩種狀態(tài)下主要差異蛋白，以期為體外受精-胚胎移植研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料 12只均為6周齡的健康雌性ICR小鼠按隨機數字表法分為實驗組和對照組，每組6只。實驗組小鼠體重（25.4±2.8）g，對照組小鼠體重（26.3±3.0）g，兩組小鼠體重無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。實驗組腹腔注射孕馬血清（PMSG，麗珠集團麗珠制藥廠，50IU/0.2ml）10 IU/只，48h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠集團麗珠制藥廠，50IU/0.2ml）10 IU/只。對照組不作任何處理。注射HCG后第2天同時處死兩組小鼠，取出子宮；用眼科鑷夾住單側子宮角，用彎頭鑷從近輸卵管端向子宮頸方向擠壓滾動獲取子宮內膜；4℃的0.9%氯化鈉溶液反復沖洗組織，濾紙吸干后分裝至EP管并置于液氮罐中保存。

1.2 蛋白提取及定量 將冷凍的內膜組織取出并充分研磨，加入裂解液，30℃恒溫水浴1h以充分溶解蛋白；15 000g離心15min，收集上清液；將收集的上清液再次離心以充分去除不溶性雜質，獲取子宮內膜組織的蛋白提取液；采用Bradford法測定蛋白濃度。

1.3 雙向電泳分離 對蛋白提取液進行等電聚焦電泳和十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，每組3次重復上樣檢測。電泳結束后采用考馬斯亮藍染色法對凝膠進行染色。染色后的凝膠應用Image Scanner掃描儀進行掃描，采用PDquest8.0軟件對圖像進行分析，包括凝膠蛋白點檢測、圖像背景扣除、蛋白點灰度值標準化、不同凝膠間蛋白點匹配。比較兩組的雙向電泳圖片進行，以變化倍數＞2倍且P＜0.05為標準篩選差異蛋白。

1.4 質譜分析 將凝膠上切取的蛋白點進行漂洗、考染、酶解、萃取、凍干、加入基質和質譜靶點樣等操作；使用ABI5800串聯(lián)飛行時間質譜儀進行質譜點靶鑒定；根據數據進行蛋白質數據庫驗證。

2 結果

2.1 蛋白雙向電泳圖譜分析 兩組的電泳圖譜均有很好的重復性，圖譜大體一致，小鼠子宮內膜組織蛋白質分子量主要集中在14.4~116 kDa，等電點主要分布在pH 4.0~9.0。實驗組與對照組相比，2倍以上差異表達蛋白總數為89個，其中上調表達75個，下調表達14個。兩組小鼠子宮內膜蛋白電泳圖譜及差異蛋白標注見圖1。

圖1 兩組小鼠子宮內膜蛋白電泳圖譜及差異蛋白標注（a：實驗組；b：對照組）

2.2 差異蛋白質譜分析 從89個差異蛋白中選取16個蛋白質點進行了質譜分析，經過查找和確認，其中7個下調的蛋白質點均鑒定為血清蛋白干擾，共檢測出9種有意義的差異表達蛋白，其中上調蛋白8個，下調蛋白1個，詳見表1。

表1 9種有意義的差異蛋白

3 討論

體外授精-胚胎移植的胚胎種植率目前仍停留在低水平，據統(tǒng)計由于子宮內膜容受性原因導致的著床失敗占2/3左右，大大限制了輔助生育技術的成功率[2]。評價子宮內膜-胚胎發(fā)育同步與否和篩選其標志物指導臨床選擇胚胎移植時機，是提高妊娠率的研究方向之一。

有研究表明不孕癥人群與正常生育人群的子宮內膜蛋白質存在一定的差異[3]，這說明功能蛋白在子宮內膜容受性的調節(jié)中起著重要作用。在體外授精－胚胎移植的過程中，促排卵藥物的使用，對子宮內膜的容受性造成一定的影響，導致子宮內膜和胚胎發(fā)育不同步，影響胚胎著床[3]。譚真等[4]通過比較自然周期胚胎植入窗口前期和植入窗口期的子宮內膜的蛋白質組成，發(fā)現存在差異的蛋白質點共31個，其中17個上調表達，14個下調表達。涉及到細胞遷移與融合、酶活性改變、信號轉導與基因調控、免疫調節(jié)、血管生成和凝血纖溶等6個系統(tǒng)。子宮內膜上皮細胞吞飲泡、整合素αVβ3、白血病抑制因子、血管內皮生長因子的表達可以部分地反映子宮內膜對胚胎的容受性。但至今為止，還未能找到更完整的、能動態(tài)反映子宮內膜對胚胎容受性變化的方法。

本研究中上調倍數較高的谷胱甘肽轉移酶屬于子宮內膜的分泌蛋白，在孕激素產生旺盛的黃體細胞和卵泡膜細胞均含有，提示其在卵巢合成甾體激素,特別是孕酮的產生過程中起重要作用。谷胱甘肽轉移酶還與細胞的凋亡調控有關，可以促進子宮內膜細胞凋亡，幫助內膜做好胚胎著床前的準備。另一上調倍數較高的蛋白為視黃醛脫氫酶2，是合成視黃酸所必須的酶,也是啟動減數分裂的關鍵信號，可以促進卵巢合成視黃酸啟動減數分裂。實驗組小鼠子宮內膜角蛋白，I型細胞骨架蛋白表達是對照組的3.1倍，在劉倍余等[5]的研究中也發(fā)現胚胎反復種植失敗的婦女種植窗時期子宮內膜的細胞骨架蛋白質存在異常表達，這與國外一些學者的研究結果一致[6]。

本研究結果中唯一的下調蛋白是抗胰蛋白酶1-3，在人類子宮內膜檢測證實α1抗胰蛋白酶是在分泌期和種植窗期高表達的[7]，說明其與子宮內膜容受性呈正相關，α1抗胰蛋白酶可以通過抑制蛋白酶活性，參與子宮內膜微環(huán)境的蛋白水解，可能可以作為子宮內膜容受性的生物學標志物，具體機制尚有待進一步研究。

長期以來，胚胎著床的分子機制一直都是生殖生物學領域的研究熱點。胚胎著床是由多種因素協(xié)同作用的復雜過程，各種因子處在這一調控網絡的各個結點上，與其他結點上的因子相互聯(lián)系，相互制約。其中激素及其它著床因子的相互作用和它們在胚胎著床調節(jié)鏈中的位置、作用途徑還有待進一步探討。如可通過監(jiān)測各種生長因子的水平了解胚胎的發(fā)育情況、著床潛力等，從而使其成為研究胚胎著床機制的切入點，可為提高COH周期的胚胎種植率和妊娠率提供理論依據和借鑒。今后可選取其中幾個差異蛋白進行種植窗期在體子宮內膜組織表達的定位和半定量驗證，以進一步研究探討其在調節(jié)子宮內膜容受性方面的作用。

[1] Horcajadas J A,Riesewijk A,Polman J,et al.Effect of controlled ovarian hyperstimulation in IVF on endometrial gene expression profiles[J].Mol Hum Rep rod,2005,11(3):195-205.

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[3] Ledee-Bataille N,Lapree-Delage G,Taup in J L,et al.Concen-tration of leukaemia inhibitory factorLIF inuterine flushing Fluid is highly predictive of embryo implantation[J].Hum Reprod, 2002,17(1):213-218.

[4] 譚真,李潔,黎明濤,等."種植窗"時期人類子宮內膜組織差異蛋白質表達譜的初步研究[J].中國病理生理雜志,2012,28(2):201-206.

[5] 劉倍余,李潔,劉明濤,等.反復種植失敗婦女"種植窗"時期子宮內膜組織的細胞骨架蛋白質的差異表達 [J].生殖醫(yī)學雜志,2014,23(11): 907-912.

[6] Rai P,Kota V,Sundaram C S,et al.Proteome of human endometrium:Identification of differentially expressed proteins in proliferative and secretory phase endometrium[J].Proteomics Clin Appl,2010,4(1):48-59.

[7] Parmar T,Gadkar-Sable S,Savardekar L,et al.Protein profiling of human endometrial tissues in the midsecretory and prolif-erativephases of the menstrual cycle[J].Fertil Steril,2009,92(3): 1091-1103.

Effect of controlled ovarian hyperstimulation on expression of protein profile in preimplanted endometrium of mice

ZHOU Wenjing，FENG Ying，SHEN Rongrong，et al.Department of Reproduction,Hangzhou Maternity Hospital，Hangzhou 310009,China

Objective To investigate the effect of controlled ovarian hyperstimulation(COH)on expression of protein profile in preimplanted endometrium of mice.Methods Twelve ICR mice were randomly divided into experimental and control groups, COH was given to mice in experimental group.Differential expression of proteins in preimplanted endometrium was analyzed by using two-dimensional gel electrophoresis (2D-DIGE)and matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS).Results There were 89 proteins differentially expressed＞2 fold in the endometrium between experimental group and control group.Among 89 differentially expressed proteins 16 were further examined with MALDI-TOF-MS and 9 significantly expressed proteins were found.Conclusion Controlled ovarian stimulation can lead to changes in expression of protein profile on the preimplanted endometrium of mice,and screening of endometrial receptivity markers may facilitate to raise the implantation and pregnancy rate.

Embryo implantation Controlled ovarian hyperstimulation Endometrium Mice

2015-07-08）

（本文編輯：李媚）

浙江省人口計生委科研項目（JSW 2013-A036）

310009杭州市婦產科醫(yī)院生殖中心

費小陽，E-mail：feixy1962@163.com