李雨函，蘇靜芬，張晨，石亮，劉云波

(1．中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京 100021;2．北京大學生命科學學院，北京 100871)

與目前廣泛使用的嚙齒動物相比，非人靈長類動物在生理、發(fā)育、行為、免疫以及基因背景與人類更加相近。在藥物研發(fā)和安全性評價中，為減少嚙齒動物與人類基因背景的差距所帶來的不穩(wěn)定性和局限性，非人靈長類已成為重要的腫瘤研究和藥物評價的實驗動物［1］。

雖然一直有非人靈長類自發(fā)神經(jīng)、消化道等腫瘤的報道，但因發(fā)生率較低難以用其自發(fā)腫瘤作為研究模型［2］。此外，在研究中由于非人靈長類動物個體間基因背景差異明顯，對統(tǒng)計的分析要求較復雜，明顯的個體基因差異也影響研究結(jié)果的分析和解釋。因此，利用癌癥相關基因和基因工程技術建立和發(fā)展非人靈長類腫瘤模型動物為癌癥機制的研究和抗癌藥物研發(fā)以及臨床前實驗服務具有重要意義［3］。

P21Waf1/Cip1/Sdi1(文中簡稱P21)是細胞周期素依賴性激酶抑制因子，屬于CIP 家族。P21 具有廣泛的CDK 抑制活性，因其作用于細胞周期減少受損DNA 的復制和積累，發(fā)揮抑癌作用，長期以來被認為具有抑制腫瘤的功能。近些年對P21 的研究發(fā)現(xiàn)在Trp53－/－和Atm－/－小鼠自發(fā)性淋巴瘤中P21 并沒有抑制腫瘤的發(fā)生，因此有提出在特定的細胞環(huán)境和條件下P21 有可能是致癌基因［4，5］。P21 在癌癥發(fā)生和發(fā)展中的功能非常重要，而其作用并不完全清楚。為利于以后建立相應基因沉默動物模型、深入研究P21 在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中的作用和功能，本研究從細胞水平篩選并確定了恒河猴P21 基因的沉默靶點，為進一步探討P21 的功能作用奠定細胞水平的基礎研究。

1 材料和方法

1.1 材料

COS-7 購自中國醫(yī)學科學院基礎研究所細胞中心，Vero，Vero-E6 購自ATCC 細胞庫。含有ubiquitin promoter (Ubi promoter)調(diào)控的紅色熒光蛋白tandem dimer tomato(tdt)報告基因的FUGW-TDT 慢病毒載體由北京大學實驗室保存。胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶為Invitrogen-Gibco 公司產(chǎn)品。細胞培養(yǎng)基DMEM 購自Hyclone;質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Invitrogen;PCR 試劑盒購自TaKaRa 公司;E．coli DH5α 感受態(tài)細胞購自全式金公司;鼠抗猴P21 單克隆抗體，購自Santa Cruz公司;HRP 標記的羊抗鼠-HRP 購自Sigma;PCR 檢測引合成及測序均由Invitrogen 公司提供;β-actin抗體購自上海康成生物;Xho I 和Xba I 購自NEB。

1.2 shRNA 的設計

Life technology 在線shRNA 設計工具，根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中恒河猴 P21 基因的序列(NM _00194722.2)，依照shRNA 設計原則，選擇五個靶點設計shRNA 序列(序列見表1)。靶點均與非洲綠猴P21 基因同源。設計網(wǎng)址為(http://rnaidesigner．lifetechnologies．com/rnaiexpress/setOption．do?designOption=shrna＆pid=261946071111563135)。

1.3 P21-RNA 干擾慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定

載體構(gòu)建參考文獻［6］。用Xho I 和Xba I 對FUGW-TDT 載體進行酶切消化，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收、純化后備用。載體與需要導入的shRNA 按比例混合16℃過夜連接后轉(zhuǎn)化至E．coli DH5α 中，37℃培養(yǎng)后挑取單菌落培養(yǎng)后進行 菌 液鑒 定 及測序(引物均為F:5’-AGGAAGATGGCTGTGAGG-3’;R:5’-GCCTTGTATCGTATAAGC-3’，提取陽性克隆菌液質(zhì)粒，命名為 FUGW-TDTP21shRNA。本實驗的陰性對照為未導入shRNA 的空載FUGW-TDT 空質(zhì)粒。

1.4 細胞培養(yǎng)與慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

用含有10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)上述細胞。在六孔板中按每孔(6 ～8)×105細胞種細胞，24 h 內(nèi)細胞密度達70% ～80%時進行轉(zhuǎn)染。實驗分空載質(zhì)粒組(陰性對照)和FUGW-TDT-shP21 質(zhì)粒組。其中質(zhì)粒組分別為四個針對不同靶點設計的質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染按照Polyethylenimine (PEI)試劑說明操作，48 h后觀察熒光。

1.5 RT-PCR 檢測各組細胞中mRNA 的表達

收集各組細胞按照Invitrogen Trizol Reagent 說明書分別提取細胞總RNA，測量其濃度后按試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄和PCR。P21 基因引物為F:5’-CGAAGTCAGTTCCTTGTGGG-3 ’， R: 5 ’-CATTAGCGCATCACAGTCGC-3’預計擴增出188 bp 左右的目的片段。內(nèi)參GAPDH，其引物序列參考文獻［7］，F(xiàn):5’- ACATCATCCCTGCCTCTACTG-3’，R:5’AGTGGGTGTCGCTTTGAAGTC-3’，預計擴增出261 bp 左右的目的片段。PCR 反應程序:94℃預變性2 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.6 Western blot 檢測各組細胞中P21 蛋白的表達

轉(zhuǎn)染細胞48 h 后棄掉細胞培養(yǎng)液、吸凈殘液，加入預冷的1 × PBS 沖洗兩次后加入1 × SDS 裂解液，均勻吹打細胞后收集裂解產(chǎn)物，高速離心后收取上清測定總蛋白濃度。SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳用8% 的分離膠以及4%的積層膠，總蛋白上樣量為20 μg。轉(zhuǎn)膜后加鼠抗猴P21 單克隆抗體(1∶1000)封閉液4℃孵育過夜，1 × PBS 充分洗膜后加入HRP 標記的羊抗鼠IgG(1∶5000)封閉液孵育3 h，曝光、顯影后用Image J 軟件進行灰度掃描分析。

1.7 統(tǒng)計分析

進行方差齊性檢驗后采用Fisher 檢驗，P ＜0.05認為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 恒河猴P21 基因沉默靶點和shRNA

Life technology 在線設計shRNA 序列，在恒河猴P21mRNA 中的位置見表1。

表1 恒河猴P21 基因沉默靶點Tab．1 The sites of P21 gene silencing in the rhesus monkeys

2.2 細胞中P21 豐度的檢測

選取Vero、Vero-E6、COS-7 三種細胞提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，普通PCR 后電泳檢測P21 豐度(圖1)。結(jié)果顯示三種細胞P21 的豐度均較高，但實驗中COS-7 比Vero、Vero-E6 更易轉(zhuǎn)染，因此本研究室優(yōu)先選取COS-7 用于基因抑制效率檢測。

圖1 P21 細胞豐度檢測Fig．1 Detection of the P21 abundance

2.3 檢測轉(zhuǎn)染細胞中P21 基因mRNA 的表達

轉(zhuǎn)染48 h 后提取RNA，RT-PCR 檢測P21 mRNA 在COS-7 細胞中的表達，trizol 法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行real-time PCR，按2-ΔΔCt法進行計算。與空載 FUGW-TDT 質(zhì)粒相比，四個靶位點在P21mRNA 水平的沉默效率均明顯(P ＜0. 05)，其中FUGW-TDT-P21shRNA-1 的沉默效率為(91.82±3.21)%，F(xiàn)UGW-TDT-P21shRNA-2 的沉默效率為(82.47±2.48)%，F(xiàn)UGW-TDT-P21shRNA-3 的沉默效率為(81.31±2.69)%，F(xiàn)UGW-TDT-P21shRNA-4的沉默效率為(87.35±4.59)%(圖2)。

圖2 SYBR-Green 法real-time PCR 檢測P21 基因mRNA 的表達Fig．2 Detection of P21mRNA by real-time PCR

2.4 FUGW-TDT shRNA 對cos-7 細胞中P21 蛋白表達的抑制作用

Western blot 檢測COS-7 細胞中P21 的表達量，結(jié)果顯示P21 shRNA 轉(zhuǎn)染的細胞P21 蛋白的表達量較對照組明顯減少。經(jīng)圖像軟件進行灰度分析，其中FUGW-TDT-P21shRNA-1 轉(zhuǎn)染后細胞P21 表達量為(11.97±0.70)%，F(xiàn)UGW-TDT-P21shRNA-2 轉(zhuǎn)染后細胞P21 表達量為(20.22±0.65)%，F(xiàn)UGWTDT-P21shRNA-3 轉(zhuǎn)染后細胞P21 表達量為(23.21± 0.63)%，F(xiàn)UGW-TDT-P21shRNA-4 轉(zhuǎn)染后細胞P21 表達量為(14.42± 0.86)% (圖3)。Western blot 顯示的結(jié)果和real-time PCR 保持一致，四個靶位點在P21 蛋白水平的沉默效率明顯。

圖3 Western Blot 檢測COS-7 細胞中P21 蛋白的表達量Fig．3 Detection of P21 protein by Western blot．

3 討論

在CDKN1A－/－小鼠發(fā)生自發(fā)性腫瘤是P21 首次從基因?qū)W證明其具有抑癌作用，雖然人類的直腸癌、宮頸癌、腦頸部癌癥、肺癌等大多數(shù)癌癥的發(fā)展都與P21 的表達相關，但并沒有證明CDKN1A 的變異使P21 的功能完全喪失，但可以說明P21 在抑癌作用中發(fā)揮著重要作用，和其他一些抑癌因子共同調(diào)節(jié)抑制腫瘤發(fā)生和惡化［8］。P21 與腫瘤 的分化、浸潤深度、增生和轉(zhuǎn)移有關，具有判斷預后的價值。

現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)在特定條件下P21 的錯誤調(diào)控和表達也會致癌。在人類前列腺癌、乳腺癌、鱗狀細胞癌都有P21 過量表達，雖然沒有直接證據(jù)證明P21 過量表達與癌癥直接相關，或是此類發(fā)現(xiàn)有可能是受到化療和放療的影響，但P21 是致癌基因的理論在少量基因小鼠的研究中已被發(fā)現(xiàn)［4，9］。

本研究中real time PCR 和Western blot 分析RNA 干擾的COS-7 細胞中P21 mRNA 水平和蛋白表達量均比對照組顯著降低，且二者結(jié)果一致，有助于建立P21 沉默的恒河猴模型。

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