朱艷含，羅勇 ，胥虹貝，王盼欣

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

缺血性卒中(ischemic stroke)，約占全部腦卒中的70%，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。如何改善急性腦缺血后的血供，增加缺血區(qū)的血管再生從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)日益成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有較強(qiáng)促血管再生能力的一種干細(xì)胞。研究表明，EPCs 主要存在于機(jī)體的骨髓中，在某些病理生理環(huán)境下，可以從骨髓動(dòng)員至外周血循環(huán)［1］。當(dāng)機(jī)體發(fā)生急性腦梗死時(shí)，如何更加有效地調(diào)動(dòng)內(nèi)源性(即骨髓內(nèi))EPCs 參與腦梗死后的血管再生是目前研究的熱點(diǎn)之一。前期研究發(fā)現(xiàn)電針可促進(jìn)腦梗死大鼠的血流恢復(fù)及血管再生，并改善其神經(jīng)功能癥狀［2－4，13］，但具體機(jī)制尚不十分明確。研究表明，eNOS 的磷酸化可促進(jìn)NO 的釋放并激活MMP－9，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)源性EPCs 的釋放［5－6］。本研究將電針與eNOS 通路相結(jié)合來(lái)研究局灶腦缺血/再灌注后內(nèi)源性EPCs 的動(dòng)員情況，進(jìn)一步探討電針治療腦梗死的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF 級(jí)成年雄性SD 大鼠100 只，250 ～300 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心【SCXK(渝)2012－0002】提供，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心【SYXK(渝)2010－0002】提供實(shí)驗(yàn)操作平臺(tái)，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。100 只大鼠隨機(jī)分為正常組(N 組)、模型組(I/R 組)、模型+電針組(I/RE 組)、模型+電針+L－NAME 組(I/REL 組)，除N 組外的其余三組根據(jù)局灶腦缺血1.5 h 再灌注后的觀察時(shí)間點(diǎn)，分為1、2、7 d 三個(gè)亞組，各亞組10 只。

1.2 主要試劑

兔抗大鼠VEGFR2 抗體購(gòu)自CST 公司，Biotin－KDR 購(gòu)自Novus Biology 公司，F(xiàn)ITC－鏈球菌抗生物素蛋白購(gòu)自eBiosciense 公司，小鼠抗大鼠CD34 抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology 公司，L－NAME 購(gòu)自北京碧云天公司，免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，熒光定量PCR 相關(guān)試劑購(gòu)自Takara 公司。

1.3 動(dòng)物模型制備及評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

線栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈局灶腦缺血/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)［7－8］。缺血1.5 h。大鼠清醒后根據(jù)Longa 等［9］5 分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)分。以評(píng)分為2、3 分為納入標(biāo)準(zhǔn)。因各種原因不能納入實(shí)驗(yàn)的大鼠，相應(yīng)組別通過(guò)隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊。

1.4 電針刺激方法及腹腔給藥

針刺方法:選擇大鼠“百會(huì)”穴(GV 20)及左側(cè)“四關(guān)”穴(合谷LI 4/太沖LR 3)作為針刺穴位。取華佗牌不銹鋼銀針(直徑為0.38 mm，長(zhǎng)度為1 寸)一根斜刺“百會(huì)”穴;兩根直刺“合谷”穴，間距約2 mm;兩根直刺“太沖”穴，間距約2 mm。連接電針治療儀，頻率為2/20 Hz，波型為疏密波，針刺20 min，每日一次，強(qiáng)度以大鼠左側(cè)肢體輕微顫動(dòng)為宜。腹腔注射L－NAME(eNOS 抑制劑):造模成功后，立即給予藥物抑制組大鼠腹腔注射L－NAME，注射濃度為8 mg/kg，配藥濃度為8 mg/mL (每8 mg 的LNAME 溶于1 mL 的生理鹽水)［10］。

1.5 取樣及檢測(cè)

1.5.1 取材

每組取5 只大鼠到相應(yīng)觀察時(shí)間點(diǎn)時(shí)，采集腹主動(dòng)脈血約2 mL，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)備用;預(yù)冷的PBS 沖出雙側(cè)后肢骨腔中的骨髓細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)在1 ×106～1×107左右，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)備用;流式取材完畢立即斷頭取腦，取大腦中動(dòng)脈供血范圍的缺血大腦皮質(zhì)，－80℃保存，熒光定量PCR 備用。各組其余5只大鼠到相應(yīng)觀察時(shí)間點(diǎn)時(shí)，經(jīng)左心室內(nèi)固定腦組織，取視交叉前后2 mm 腦組織作石蠟切片。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血及骨髓EPCs 數(shù)量(EPCs 占單核細(xì)胞數(shù)量的百分比)

取外周血及骨髓細(xì)胞懸液各100 μL，分別加1 μL 兔抗大鼠VEGFR2 抗體避光孵育30 min，繼而加2 mL 紅細(xì)胞裂解液避光孵育5 min，4℃下1500 r/min 離心5 min，棄上清，2 mL PBS 重懸離心洗滌2次之后，加FITC 標(biāo)記的二抗避光孵育30 min，2 mL PBS 重懸離心洗滌之后用100 μL PBS 重懸細(xì)胞沉淀，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)EPCs 數(shù)量。

1.5.3 熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)缺血大腦皮質(zhì)VEGFR2 mRNA 的表達(dá)

將保存于－80℃的缺血大腦皮質(zhì)取出，按Takara 說(shuō)明書提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成20 μL 體系的cDNA。據(jù)GenBank 提供的序列，擴(kuò)增大鼠VEGFR2 mRNA的上游引物為5′－GGAAAGGGTGTT GGTGACTG－3′，下游引物為5′－GGTGTCCCGATAGAAGCACT－3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度112 bp。擴(kuò)增條件為預(yù)變性95℃30 s，PCR 反應(yīng)95℃5 s、60℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.5.4 免疫組化法檢測(cè)腦缺血區(qū)VEGFR2 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)及CD34 微血管計(jì)數(shù)

根據(jù)免疫組化試劑盒步驟對(duì)腦組織石蠟切片進(jìn)行處理。結(jié)果的判定:VEGFR2 陽(yáng)性細(xì)胞:采用Image－Pro Plus 16.0 圖像測(cè)量分析軟件計(jì)算VEGFR2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/HP)。微血管密度:所有切片均編號(hào)，取非連續(xù)的3 張切片，每張切片讀取2 個(gè)非連續(xù)視野數(shù)值。缺血區(qū)微血管計(jì)數(shù)(microvessel count，MVC)結(jié)果的判定:在200 倍視野下觀察，染成棕褐色或棕黃色的細(xì)胞或細(xì)胞簇，直徑＜20 μm，與相鄰的血管分界清楚，均認(rèn)為是1 條微血管。由第一作者和另2 名經(jīng)過(guò)專業(yè)訓(xùn)練的專業(yè)技術(shù)人員觀察計(jì)數(shù)，微血管數(shù)(個(gè)/HP)為每個(gè)視野下的血管數(shù)。

1.5.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠外周血VEGFR2+EPCs 數(shù)量變化情況

大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后I/R 組外周血VEGFR2+EPCs 數(shù)量明顯高于N 組(P ＜0.05，P ＜0.01);I/RE 組在各時(shí)間點(diǎn)與I/R 組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01，P ＜0.05);而I/REL 組的VEGFR2+EPCs 數(shù)量相比I/RE 組則顯著降低(P ＜0.01)。見圖1。

圖1 各組大鼠外周血VEGFR2 +EPCs 數(shù)量的比較Fig．1 Comparison of VEGFR2 +EPCs percentage in the rat peripheral blood of each group

2.2 大鼠骨髓VEGFR2+EPCs 數(shù)量變化情況

大鼠局灶腦缺血/再灌注損傷后1、2d I/R組骨髓VEGFR2+EPCs 數(shù)量明顯高于N 組(P ＜0. 01)，7d 時(shí)與N 組相比無(wú)差異(P ＞0. 05);I/RE 組在各時(shí)間點(diǎn)與I/R 組相比有顯著差異(P＜0. 01，P ＜0. 05);而I/REL 組 的VEGFR2+EPCs 數(shù)量相比 I/RE 組則顯著降低(P ＜0. 01)。見圖2。

2.3 大鼠局灶大腦缺血皮質(zhì)區(qū)VEGFR2 mRNA及VEGFR2 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況

與N 組比較，I/R 組各時(shí)間點(diǎn)VEGFR2 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)均增高(P ＜0.01);I/RE 組各時(shí)間點(diǎn)VEGFR2 mRNA 的表達(dá)量及VEGFR2 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較I/R 組均明顯增高(P ＜0.01);當(dāng)eNOS 被抑制后，電針促VEGFR2 mRNA 及VEGFR2 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)作用則明顯降低(P ＜0.01)。見圖3、表1。

圖2 各組大鼠骨髓VEGFR2 +EPCs 數(shù)量的比較Fig．2 Comparison of VEGFR2 +EPCs percentage in the rat bone marrow of each group

圖3 各組大鼠缺血腦皮質(zhì)區(qū)VEGFR2 陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況(×200)Fig．3 VEGFR2－positive cells in the ischemic cerebral cortex of rats in each group(×200)

表1 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)VEGFR2 mRNA 及VEGFR2陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)Tab．1 The expression of VEGFR2 mRNA and VEGFR2 +cells in ischemic cerebral cortex of the rats in each group

2.4 大鼠局灶大腦缺血皮質(zhì)區(qū)CD34 微血管計(jì)數(shù)

與I/R 組比較，I/RE 組各時(shí)間點(diǎn)CD34 微血管計(jì)數(shù)均顯著增多(P ＜0.01)，在eNOS 被抑制后電針促微血管生成的作用顯著降低(P ＜0.01)。見圖4。

3 討論

在我國(guó)針刺用于治療腦梗死已有數(shù)千年的歷史。研究表明，電針可通過(guò)促骨髓干/祖細(xì)胞如EPCs 等的動(dòng)員來(lái)參與缺血區(qū)血管的再生［11］。EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在成人主要存在于骨髓。在缺血缺氧等病理因素的刺激下，EPCs 可從骨髓動(dòng)員出去，并歸巢至缺血靶區(qū)參與血管再生［12－13］?，F(xiàn)階段關(guān)于可以準(zhǔn)確代表EPCs 的表面標(biāo)記物的研究尚未明確，一致認(rèn)為VEGFR2、CD34、CD31、CD133 等為主要標(biāo)記物，其中VEGFR2+EPCs具有較強(qiáng)的血管修復(fù)能力［14］。

圖4 各組大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)CD34 微血管計(jì)數(shù)的比較(×200)Fig．4 Comparison of the number of CD34 +blood vessels in ischemic cerebral cortex in the rats of each group(×200)

張彤等［15］發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理可上調(diào)局灶腦缺血/再灌注后大鼠骨髓及外周血中VEGFR2+EPCs 數(shù)量，推測(cè)電針對(duì)腦梗死的修復(fù)作用與對(duì)EPCs 的動(dòng)員有關(guān);孫宏毅等［12］研究表明電針治療后局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓及外周血中VEGFR2+EPCs 數(shù)量明顯增高，推測(cè)電針動(dòng)員EPCs 可促腦缺血區(qū)血管再生。此外，電針還可以上調(diào)局灶腦缺血/再灌注大鼠外周血中VEGFR2+PECAM－1+EPCs、VEGFR2+CD31+EPCs、CD34+EPCs 等的數(shù)量，從而促進(jìn)血管再生［16－18］。組織發(fā)生缺血后，是通過(guò)何種途徑將骨髓龕內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)的EPCs 激活并動(dòng)員至外周血，進(jìn)而參與缺血組織的血管再生，是目前研究的熱點(diǎn)。

研究表明，eNOS 在干/祖細(xì)胞的動(dòng)員及缺血組織的保護(hù)中起關(guān)鍵作用。Kim 等［19］發(fā)現(xiàn)電針提高小鼠局灶腦缺血后的腦血流量及改善神經(jīng)功能缺損癥狀的作用，在敲除eNOS 基因的小鼠體內(nèi)明顯受到抑制。Cui 等［6］發(fā)現(xiàn)eNOS 可以促進(jìn)腦梗死后的血管再生，敲除eNOS 基因的小鼠腦梗死后較野生型小鼠死亡率增高，神經(jīng)功能缺損癥狀更為明顯，在使用NO 供體DETA－NONOate 后明顯改善。Aichner等［20］發(fā)現(xiàn)缺乏eNOS 的小鼠，VEGF 誘導(dǎo)的EPCs 的動(dòng)員能力顯著降低。同時(shí)，研究表明SDF－1α 對(duì)EPCs 的動(dòng)員作用，亦可在eNOS 被阻斷后受到抑制［21］。提示eNOS 在EPCs 的動(dòng)員及缺血后腦保護(hù)中處于關(guān)鍵地位。故本研究旨在探討電針對(duì)EPCs的動(dòng)員作用及對(duì)腦梗死的保護(hù)作用是否是通過(guò)對(duì)eNOS 的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電針可以促進(jìn)局灶腦缺血/再灌注大鼠骨髓及外周血中VEGFR2+EPCs 的數(shù)量，其中骨髓內(nèi)VEGFR2+EPCs 數(shù)量隨大鼠缺血時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，而外周血中VEGFR2+EPCs 數(shù)量則是先有一個(gè)增多的趨勢(shì)繼而再減少，可能與VEGFR2+EPCs 在機(jī)體內(nèi)先由骨髓內(nèi)動(dòng)員至外周血，之后又歸巢到缺血腦區(qū)有關(guān);同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)電針上調(diào)大鼠缺血大腦皮質(zhì)中VEGFR2 mRNA 及VEGFR2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)，這種作用在eNOS 被阻斷后受到抑制，有可能提示eNOS 被阻斷后，電針促局灶腦缺血后VEGFR2 陽(yáng)性細(xì)胞的歸巢能力減弱;且電針治療后大鼠缺血大腦皮質(zhì)區(qū)微血管的數(shù)量生成增多，而電針的這種對(duì)腦梗死大鼠的保護(hù)作用在使用eNOS 抑制劑后明顯減弱。研究表明，電針可上調(diào)eNOS 的表達(dá)［22］。故我們推斷電針或可通過(guò)介導(dǎo)eNOS 的激活來(lái)促局灶腦缺血后骨髓EPCs 動(dòng)員至外周血，上調(diào)骨髓及外周血中EPCs 數(shù)量，同時(shí)歸巢到缺血腦區(qū)的EPCs 數(shù)量增加，進(jìn)而促進(jìn)缺血大腦皮質(zhì)區(qū)的血管再生。

本研究對(duì)電針動(dòng)員EPCs 的機(jī)制做了較為深入研究，既往研究發(fā)現(xiàn)電針一方面可以上調(diào)外周血及骨髓EPCs 的數(shù)量，另一方面可以上調(diào)VEGF、SDF－1α、eNOS 等一系列與EPCs 動(dòng)員、歸巢密切相關(guān)的因子，但大多未將電針動(dòng)員EPCs 的機(jī)制與介導(dǎo)相關(guān)通路結(jié)合起來(lái)，僅是推測(cè)電針動(dòng)員EPCs 是通過(guò)激活EPCs 動(dòng)員相關(guān)因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的，故本研究在既往的研究基礎(chǔ)上，更加深入的探討了電針動(dòng)員內(nèi)源性EPCs，進(jìn)而歸巢到缺血腦區(qū)參與血管再生的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)使用eNOS 抑制劑L－NAME 后電針對(duì)局灶腦缺血大鼠EPCs 的動(dòng)員作用及對(duì)腦血管的保護(hù)作用明顯受到抑制。可見電針可通過(guò)介導(dǎo)eNOS 動(dòng)員內(nèi)源性EPCs 促局灶腦缺血大鼠腦內(nèi)血管再生，進(jìn)一步證明了電針治療腦梗死的作用機(jī)理，為電針在臨床上治療腦梗死中提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

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