齊曉瑩，蔣中秀，劉洋，李寧，張曉曄

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第四腫瘤科，沈陽(yáng) 110022）

·論著·

沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1在直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

齊曉瑩，蔣中秀，劉洋，李寧，張曉曄

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第四腫瘤科，沈陽(yáng) 110022）

目的探討沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）在直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用免疫組化法檢測(cè)86例直腸癌組織和30例癌旁正常直腸組織中SIRT1的表達(dá)情況，并與臨床病理資料進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果直腸癌組織中SIRT1的陽(yáng)性表達(dá)率為88.4%，癌旁正常組織陽(yáng)性率為16.6%，顯著高于癌旁正常直腸組織（P＜0.001）；直腸癌組織中SIRT1的表達(dá)與TNM分期（P＜0.05）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有無(wú)（P＜0.05）、腫瘤浸潤(rùn)深度（P＜0.05）呈正相關(guān)；與腫瘤組織分化程度（P＜0.05）呈負(fù)相關(guān)；而與性別、年齡、腫瘤直徑無(wú)關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論SIRT1在直腸癌中表達(dá)明顯高于癌旁正常直腸組織，且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)深度及腫瘤分化程度密切相關(guān)。提示SIRT1在直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能具有重要作用，可以作為直腸癌判斷預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1；直腸癌；免疫組化

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，近30年來(lái)大腸癌在我國(guó)的發(fā)病率及死亡率明顯上升，我國(guó)大腸癌中以直腸癌多見，占大腸癌的60%～75%，嚴(yán)重危害人們的身體健康。大腸癌的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，而細(xì)胞的凋亡受到多基因的調(diào)控。SIRT1是一種依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶［1，2］。通過(guò)對(duì)組蛋白及非組蛋白的乙?；瘉?lái)參與調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖以及凋亡。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示，SIRT1在許多人類惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，如前列腺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等，提示其可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)對(duì)86例直腸癌組織中的SIRT1進(jìn)行檢測(cè)，探討直腸癌中SIRT1表達(dá)水平與相關(guān)臨床病理資料相關(guān)性及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2012年01月至2013年12月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院手術(shù)切除直腸癌石蠟標(biāo)本共86例，臨床資料完整，男性46例（53.5%），女性40例（46.5%），年齡32～79歲，平均年齡（60.1±7.5）歲。高分化4例（4.7%）、中分化78例（90.6%）、低分化4例（4.7%）；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例（65.1%）、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例（34.9%）；TNM分期按照AJCC/UICC TNM臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：I期24例（27.9%）、Ⅱ期24例（27.9%）、Ⅲ期38例（44.2%）。所有病例術(shù)前均未行化療、放療或其他治療，所有切除標(biāo)本均經(jīng)病理確診。另設(shè)30例癌旁正常直腸組織（均經(jīng)病理證實(shí)）作為對(duì)照組。所有標(biāo)本均經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，標(biāo)本連續(xù)切片，切片厚度為4 μm。

1.2 主要試劑

SIRT1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，二抗試劑盒、DAB試劑盒、二抗稀釋液等購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

免疫組化染色：采用SP法免疫組化染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性1 h，PBS漂洗5 min×3次，熱修復(fù)抗原15 min，緩慢冷卻至室溫，PBS漂洗5 min×3次，非免疫血清封閉2 h，一抗（小鼠抗人單克隆抗體1∶400）孵育4℃過(guò)夜，PBS漂洗5 min×3次，相應(yīng)二抗孵育室溫1 h，PBS漂洗5 min×3次，SP試劑每張切片1滴室溫下作用1 h，DAB顯色80 s，自來(lái)水終止顯色5 min，蒸餾水漂洗5 min，蘇木素核復(fù)染6 min，自來(lái)水沖洗10 min，蒸餾水漂洗5 min，切片脫水、透明，樹膠封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

免疫組化結(jié)果判定：SIRT1表達(dá)主要為細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒。由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片，采用半定量結(jié)果判斷，分別對(duì)鏡下陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度給予評(píng)分。參照Andre［12］評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400）計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，得出陽(yáng)性細(xì)胞百分率，根據(jù)免疫組化染色陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，＜10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分；無(wú)著色為0分，輕度著色（淺黃色）為1分，中度著色（棕黃色）為2分，重度著色（棕褐色）為3分。將上述2項(xiàng)得分相加：＜3分為陰性（-），≥3分為陽(yáng)性（+）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT-1在癌旁正常直腸組織和直腸癌組織中的表達(dá)

SIRT-1陽(yáng)性染色為癌細(xì)胞核和/或胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒。免疫組化結(jié)果表明，直腸組織中SIRT -1的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常直腸組織（χ2= 54.279，P＜0.001），見圖1，分別為88.4%（76/86）、16.6%（5/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

圖1 SIRT1在正常直腸黏膜及直腸癌組織中的表達(dá) SP×200Fig.1 The expression of SIRT1 in normal rectal mucosa and rectal cancer tissue SP×200

2.2 直腸癌組織中SIRT1的表達(dá)水平與其各種臨床病理特征的相關(guān)性

在直腸癌組織中，SIRT1表達(dá)水平高低與年齡、性別、腫瘤直徑無(wú)關(guān)（P＞0.05）；TNM分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的患者中SIRT1陽(yáng)性表達(dá)率分別為70.8%、91.7%、97.4%（χ2=10.431，P＜0.05）。有、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中SIRT1的表達(dá)率為100%和82.1%（χ2= 6.062，P＜0.05）；腫瘤未侵潤(rùn)肌層、浸潤(rùn)肌層陽(yáng)性表達(dá)率為71.4%和96.6%（χ2=11.599，P＜0.05）；高、中、低分化的陽(yáng)性表達(dá)率為50.0%、92.4%、50.0%。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明直腸癌組織中SIRT1的表達(dá)與腫瘤的TNM分期（r=0.324，P＜0.05）、浸潤(rùn)深度（r= 0.367，P＜0.05）、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（r=0.265，P＜0.05）呈正相關(guān)，而與組織的分化程度（r=-0.358，P＜0.05）呈負(fù)相關(guān)。

表1 直腸癌與正常直腸黏膜組織中SIRT-1的表達(dá)Tab.1 The expression levels of SIRT-1 in different rectum tissuse

表2 直腸癌中SIRT1的表達(dá)水平與其臨床病理特征間的關(guān)系Tab.2 Relationship between the expression of SIRT1 in colorectal cancer tissue and clinicopathological features

3 討論

SIR2相關(guān)酶類（Sir2-related enzymes，sirtuins）是1995年Sinclair等［1］于酵母中發(fā)現(xiàn)的，是一類依賴NAD+的第Ⅲ類組蛋白去乙?；浮Ｔ诓溉閯?dòng)物中，sirtuins蛋白家族有7個(gè)成員，有不同的亞細(xì)胞定位及功能［3］。SIRT1、6、7主要定位于細(xì)胞核，SIRT3-5主要定位于線粒體，SIRT2主要定位于細(xì)胞質(zhì)［4］。SIRT1是研究最多的成員，其活化后不僅能去乙?；凹谆揎椊M蛋白，還能與多種非組蛋白相互作用，參與多種細(xì)胞生理、病理過(guò)程，如細(xì)胞衰老凋亡、壽命延長(zhǎng)、DNA損傷修復(fù)、腫瘤發(fā)生、抗氧化應(yīng)激、能量代謝調(diào)節(jié)等［4］。盡管有研究認(rèn)為SIRT1可以作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，但越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示，SIRT1在許多人類惡性腫瘤中陽(yáng)性表達(dá)均上調(diào)［5～10］。為了證實(shí)SIRT1在直腸癌組織中的表達(dá)情況，本研究通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)SIRT1在直腸癌及癌旁正常直腸組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示SIRT1在直腸癌中表達(dá)明顯高于癌旁正常直腸組織，差異具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示SIRT1的高表達(dá)可能在直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

SIRT1在許多腫瘤組織中高表達(dá)，如卵巢癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌［7］，研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可從以下幾個(gè)方面參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及影響預(yù)后：（1）通過(guò)直接去乙酰化作用，調(diào)節(jié)癌基因及抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，這可能是SIRT1參與腫瘤形成的主要機(jī)制。如SIRT1通過(guò)對(duì)P53蛋白382賴氨酸的去乙?；筆53蛋白不穩(wěn)定，延長(zhǎng)細(xì)胞的生存，促進(jìn)細(xì)胞增殖［11］。（2）通過(guò)翻譯后修飾作用，影響一些轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性，包括DNA結(jié)合力、亞細(xì)胞定位及募集共轉(zhuǎn)錄因子的能力［7］，從而調(diào)控這些轉(zhuǎn)錄因子下游產(chǎn)物的表達(dá)及相應(yīng)的生物學(xué)功能。（3）SIRT1調(diào)節(jié)表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是一個(gè)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移可能機(jī)制。有研究報(bào)道：在腫瘤生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)的表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的乳腺癌細(xì)胞中SIRT1表達(dá)上調(diào)［12］，沉默SIRT1能夠恢復(fù)細(xì)胞間的鏈接，降低細(xì)胞的侵襲性［13］。（4）SIRT1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致一些腫瘤獲得多種耐藥性，該現(xiàn)象已在多種多藥耐藥癌細(xì)胞株中得到證實(shí)［14］。

本研究結(jié)果表明直腸癌組織中SIRT1的表達(dá)與腫瘤的TNM分期，浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與組織的分化程度呈負(fù)相關(guān)，提示TNM分期越晚、浸潤(rùn)肌層、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度越低的患者相應(yīng)腫瘤組織中SIRT1表達(dá)陽(yáng)性率越高。Zheng［15］及Kang等［16］研究表明，SIRT1過(guò)表達(dá)組的癌癥患者預(yù)后較差，且總生存期較短。Zhao等［10］，Cha等［17］研究胃癌、胰腺癌中SIRT1高表達(dá)與腫瘤高分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。Liang等［18］對(duì)大腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1表達(dá)與腫瘤高分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果趨勢(shì)一致。但是也有研究表明SIRT1在大腸癌及轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)較正常組織低［19］，可能SIRT1在不同的組織中有不同的生物學(xué)功能，導(dǎo)致出現(xiàn)矛盾的臨床結(jié)果。本研究結(jié)果顯示SIRT1在直腸癌腫瘤組織中高表達(dá)，且與腫瘤的浸潤(rùn)深度，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TNM分期及腫瘤分化密切相關(guān)。本研究腫瘤分化組的高分化及低分化的組織例數(shù)較少，分組不平衡，可能出現(xiàn)偏倚。

綜上，SIRT1可能在直腸癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，有可能成為直腸癌判斷預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。針對(duì)SIRT1相關(guān)生物學(xué)行為，干擾SIRT1表達(dá)，阻斷SIRT1相關(guān)信號(hào)通路，或沉默其基因表達(dá)，可能抑制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，從而提高治療直腸癌的療效，這一設(shè)想還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（編輯 裘孝琦）

Expression and ClinicalSignificance of Sir2-related Enzymes-1 in ColorectalCancer

QIXiao-ying，JIANGZhong-xiu，LIUYang，LINing，ZHANGXiao-ye
（DepartmentofOncology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110022，China）

Objective To investigate the expression and clinical significance of Sir2-related enzymes-1（SIRT1）in colorectal cancer.MethodsThe expression of SIRT1 was evaluated by immunohistochemistry in 86 selected cases of primary Colorectal cancer and 30 samples of normal rectum tissues besided carcinoma.The relationship of the expression and clinical pathological features were analyzed.ResultsThe positive expression rate of SIRT1 in Colorectal cancer tissue was 88.4%，and significantly higher than in normal rectum tissue besided carcinoma（P＜0.001）.There were no correlation between the expression ofSIRT1 and sex，age and tumordiameter，and significantpositive correlation between the expression ofSIRT1 and TNM stage（P＜0.05），lymph node metastasis（P＜0.05），infiltrating depth（P＜0.05），and negagtive correlation between the expression of SIRT1 and tumor differentiation（P＜0.05）.ConclusionThe positive expression rate of SIRT1 in colorectal cancer tissue was significantly higher than in normal rectum tissue besided carcinoma and intimate correlation with tumor differentiation，TNM stage，lymph node metastasis and Infiltrating depth.ConclusionSIRT1 may be an importantassistance gene to diagnose and judge prognosis，and may improve diagnostic rate and auxiliarily judge prognosisasa importantColorectalcancermarker.

Sir2-related enzymes-1；colorectal cancer；immunohistochemistry

R735.3

A

0258-4646（2015）07-0606-05

遼寧省自然科學(xué)基金（2014021032）

齊曉瑩（1985-），女，醫(yī)師，碩士.

張曉曄，E-mail：zhangxy1@sj-hospital.org

2015-04-17

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：