李國福，趙陽，朱孟杰，秦含玉，臧彬

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院ICU，沈陽 110004）

·論著·

α硫辛酸后處理對(duì)膿毒癥大鼠急性腎損傷的影響及機(jī)制

李國福，趙陽，朱孟杰，秦含玉，臧彬

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院ICU，沈陽 110004）

目的探討α硫辛酸（ALA）后處理對(duì)膿毒癥大鼠急性腎損傷的影響及其可能機(jī)制。方法32只雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組：正常對(duì)照組（A組）、ALA后處理對(duì)照組（B組）、膿毒癥組（C組）和膿毒癥聯(lián)合ALA后處理組（D組）。A、B 2組均行假手術(shù)，C、D 2組行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）復(fù)制膿毒癥模型。B、D 2組大鼠術(shù)后立即給予ALA 200 mg/kg灌胃。24 h后檢測(cè)大鼠血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6-）及白細(xì)胞介素1β（IL-1β）水平，腎組織行PAS染色觀察病理學(xué)改變，免疫印跡法測(cè)定NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果膿毒癥可以誘發(fā)腎臟病理學(xué)改變，與A組相比，C組SCr和BUN含量分別增加了178%和66%（P＜0.01），TNF-α、IL-6及IL-1β水平分別增加55%、114%和110%（P＜0.01）；同時(shí)NF-κB p65的磷酸化水平（144%）和細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)（102%）顯著增加（P＜0.01），并IκBα的表達(dá)下降61%（P＜0.01）。早期給予ALA可以明顯改善上述變化，與C組相比，D組SCr和BUN含量分別下降了48%和26%（P＜0.05），TNF-α、IL-6及IL-1β水平分別降低25%、37%和40%（P＜0.05）；同時(shí)NF-κB p65的磷酸化水平和細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)顯著減少41%和49%（P＜0.05），IκBα的相對(duì)表達(dá)水平增加103%（P＜0.05）。結(jié)論ALA抑制NF-κB的活化，從而改善膿毒癥相關(guān)急性腎損傷。

急性腎損傷；α硫辛酸；膿毒癥；核轉(zhuǎn)錄因子-κB

膿毒癥是指由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，常導(dǎo)致休克甚至多器官衰竭，是臨床危重癥最主要的死亡原因之一。盡管臨床上針對(duì)重癥膿毒癥的醫(yī)療技術(shù)在不斷改善，但全球每天仍有約14 000人死于其并發(fā)癥［1，2］。膿毒癥急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是最常見、最嚴(yán)重的膿毒癥并發(fā)癥，發(fā)病率高達(dá)50%，死亡率高達(dá)70%，是膿毒癥患者死亡的最主要原因，但目前仍無有效的治療手段［3］。α硫辛酸（α-lipoic acid，ALA）是一種公認(rèn)的強(qiáng)抗氧化劑，在多種疾病的研究中已顯示出益處。Cadiric等［4］報(bào)道ALA能減弱盲腸結(jié)扎和穿孔（caecal ligation and puncture，CLP）誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠的急性肺損傷并降低死亡率。但ALA在膿毒癥相關(guān)腎損傷中是否具有保護(hù)作用未見相關(guān)報(bào)導(dǎo)。本研究擬評(píng)估ALA對(duì)膿毒癥大鼠急性腎損傷的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠32只，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，［SCXK（京）2009-0004］，體質(zhì)量200～250 g。隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（A組，n=8）、ALA后處理對(duì)照組（B組，n= 8）、Sepsis組（C組，n=8）及Sepsis聯(lián)合ALA后處理組（D組，n=8）。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)方法和目的符合人類道德倫理標(biāo)準(zhǔn)和國際慣例。

1.2 模型建立及藥物處理

大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，將大鼠仰臥位四肢固定于手術(shù)臺(tái)上。行腹正中切口，逐層分離皮膚、腹膜。進(jìn)入腹腔，將腸道推向一側(cè)，找到盲腸。采用經(jīng)典的CLP方法復(fù)制大鼠膿毒癥模型。找到盲腸后，結(jié)扎盲腸末端1/2，在結(jié)扎的盲腸末端用12號(hào)針頭穿2個(gè)孔，并結(jié)扎腸系膜動(dòng)脈，在盲腸末端留置4號(hào)手術(shù)線1根，打活結(jié)，可見被結(jié)扎的盲腸立即缺血變色，術(shù)畢分層縫合關(guān)腹。造模結(jié)束后，B、D 2組大鼠立即給予ALA 200 mg/kg灌胃。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1 血清肌酐（SCr）及尿素氮（BUN）測(cè)定：CLP后24 h處死大鼠，心臟取血，常溫下1 500 r/min離心10 min，留取上清，按照試劑盒說明書操作，苦味酸法測(cè)定SCr，二乙酰肟法測(cè)定BUN含量。

1.3.2 腎臟病理組織學(xué)檢測(cè)：取腎組織1 mm3置10%甲醛中固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切成5 μm薄片，行PAS染色，光鏡下觀察。

1.3.3 血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）及白細(xì)胞介素1β（IL-1β）水平測(cè)定：全血標(biāo)本離心取血清，按照試劑盒說明書，ELISA法測(cè)定相關(guān)指標(biāo)水平。

1.3.4 Westen blot方法分析NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá)：取各組大鼠腎組織，組織裂解液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，1%Triton，0.2 mmol/L NaCl，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，2 mmol/L Aprotinin）裂解組織提取蛋白。蛋白定量后，40 μg上樣蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，70 V恒壓轉(zhuǎn)膜2.5 h后，將PVDF膜以5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h后，分別加入NF-κB抗體（1∶100）、p-p65抗體（1∶100）和IκBα抗體（1∶100），4℃孵育過夜。HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗（1∶5 000）37℃孵育45 min，化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑顯色。凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值，以β-actin和Lamin A為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)化處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組SCr、BUN水平變化

A、B 2組均行假手術(shù)，B組給予ALA后與A組相比SCr、BUN無明顯變化；而C組造模后24 h SCr、BUN水平與A組相比有明顯升高，分別增加178%和66%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；早期給予ALA處理可使SCr、BUN明顯降低，與C組相比，D組SCr、BUN含量分別下降48%和26%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組SCr、BUN測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of SCr and BUN in different groups

2.2 腎臟組織病理學(xué)變化

A、B 2組大鼠的腎小管微絨毛和基底層有廣泛的PAS陽性區(qū)域，表明腎臟組織具有完整的結(jié)構(gòu)。而C組的形態(tài)學(xué)改變以刷狀緣缺失、腎小管變性及皮質(zhì)小管空泡形成為特征。早期給予ALA，即D組可以減慢CLP手術(shù)24 h后的這些病理改變的進(jìn)展。見圖1。

2.3 各組TNF-α、IL-6及IL-1β測(cè)定結(jié)果

C組TNF-α、IL-6及IL-1β水平與對(duì)照組相比明顯升高，分別增加55%、114%和110%，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），早期給予ALA處理即D組可使TNF-α、IL-6及IL-1β水平明顯降低，與C組相比分別下降25%、37%和40%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

圖1 腎組織PAS染色 ×200Fig.1 PAS staining of kidney×200

表2 各組TNF-α、IL-6及IL-1β測(cè)定結(jié)果Tab.2 TNF-α、IL-6 and IL-1β results in different groups

2.4 NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá)變化

CLP手術(shù)后24 h，與A組相比，C組腎組織中NF-κB p65的磷酸化及細(xì)胞核表達(dá)顯著增加，IκBα的表達(dá)水平明顯降低。NF-κB p65和p-p65的相對(duì)表達(dá)量分別增加了102%和144%，IκBα的相對(duì)表達(dá)水平降低了61%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。早期給予ALA處理即D組可以明顯減少NF-κB p65在細(xì)胞核中的表達(dá)及其磷酸化水平，并恢復(fù)IκBα的表達(dá)水平。與C組相比，D組NF-κB p65和p-p65的相對(duì)表達(dá)量分別降低了49%和41%，IκBα的相對(duì)表達(dá)水平增加了103%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 腎組織IκBα、p-p65和NF-κB p65的表達(dá)Fig.2 Relative expression of IκBα，p-p65 and NF-κB p65 in the kidney

3 討論

膿毒癥是AKI的常見病因，在ICU中大約有35%到50%的AKI是由于膿毒癥引起的［5］。CLP誘導(dǎo)膿毒癥模型已被廣泛地用于研究預(yù)防和治療膿毒癥的新藥物，它能夠模擬人體疾病的病變特點(diǎn)以及病程［6，7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CLP可以誘發(fā)實(shí)驗(yàn)大鼠腎臟明確的組織病理學(xué)損傷，術(shù)后早期給予ALA處理，明顯改善了膿毒癥導(dǎo)致的腎損傷。此外，早期的ALA處理亦顯著抑制了炎性因子在血清中的表達(dá)，并且抑制了膿毒癥大鼠腎組織中激活了的NF-κB通路，提示ALA對(duì)抗膿毒癥導(dǎo)致腎損傷的可能保護(hù)機(jī)制。

ALA已被臨床試驗(yàn)和體內(nèi)研究證實(shí)是安全有效的。Cremer等［8］給大鼠灌胃ALA的LD50大于2 000 mg/kg。本研究中使用ALA 200 mg/kg給大鼠灌胃，結(jié)果表明，早期給予ALA處理降低了CLP術(shù)后膿毒癥的死亡率，降低了血清Cr和BUN水平，并減弱腎的組織損傷。ALA在本研究中觀察到的有益作用，與先前研究結(jié)果［9］ALA具有針對(duì)不同的急慢性腎病的明顯的保護(hù)作用相一致。因此，本研究不僅進(jìn)一步證明了ALA對(duì)于膿毒癥相關(guān)多器官功能障礙的治療效果，同時(shí)也表明，未來對(duì)ALA治療潛力的深入研究將是值得的。

研究發(fā)現(xiàn)血液中TNF-α在炎性反應(yīng)或內(nèi)毒素休克時(shí)出現(xiàn)較早，并迅速達(dá)到高峰，從而誘發(fā)“次級(jí)”細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6及趨化因子IL-8等的產(chǎn)生［10，11］。大量炎性因子的釋放引起毛細(xì)血管的通透性增加，血中白細(xì)胞增多、滲出、聚集，最終導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征（SIRS）。多種炎性介質(zhì)的釋放及其所導(dǎo)致的SIRS或抗炎性反應(yīng)綜合征，是促進(jìn)休克惡化甚至發(fā)展為多器官功能不全綜合征及引起死亡的重要因素之一［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠CLP造模之后，血清中TNF-α，IL-6和IL-1β的增加被早期給予ALA顯著抑制。這些數(shù)據(jù)表明，ALA減少CLP術(shù)后釋放的炎性因子，減輕腎損傷，提高生存率。

NF-κB是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，抑制NF-κB活性可使膿毒性休克時(shí)的促炎性因子的產(chǎn)生減少，從而減少多器官衰竭的發(fā)生并降低病死率［13，14］。臨床上，在急性炎癥和膿毒癥患者中，NF-κB與DNA結(jié)合活性增強(qiáng)，并與臨床嚴(yán)重程度以及致死率相關(guān)［15］。而抑制NF-κB通路在預(yù)防或治療人類疾病中是必不可少的［16，17］。這些發(fā)現(xiàn)促使我們研究ALA是否減少CLP模型中NF-κB在腎組織中的活化。本研究中，CLP術(shù)后大鼠腎組織中的NF-κB p65的磷酸化及細(xì)胞核表達(dá)顯著增加，早期的ALA處理顯著抑制了NF-κB的活化。這表明ALA在抗氧化，阻止炎性疾病發(fā)生發(fā)展的治療效果可能與抑制NF-κB活化有關(guān)。

本研究仍有一些局限性。各組動(dòng)物的數(shù)目相對(duì)較少，可能增加統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的偏倚；其次，研究只關(guān)注了CLP手術(shù)后24 h的腎組織變化，并且ALA在其他時(shí)間點(diǎn)是否有類似的益處還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，ALA后處理在CLP手術(shù)誘導(dǎo)的膿毒癥大鼠中，減輕急性腎損傷，其可能機(jī)制是通過減少炎性因子的釋放和抑制NF-κB的活化。

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（編輯 裘孝琦）

Efficacy ofα-Lipoic Acid Treatmenton Sepsis-induced Acute Kidney Injury in Ratsand Its Mechanisms

LIGuo-fu，ZHAOYang，ZHUMeng-jie，QIN Han-yu，ZANGBin
（DepartmentofCriticalCare Medicine，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the impact of α-lipoic acid（ALA）treatment on sepsis-induced acute kidney injury in rats and explore the mechanisms.MethodsA total of 32 male SD rats were randomized into 4 groups：normal control group（group A），ALA-treated control group（group B），sepsis group（group C）and sepsis with ALA treated group（group D）.Group A and B underwentsham operation，while CLP operations were conducted in group C and D.Rats in both group B and group D were then administered with 200 mg/kg ALA by oral gavage immediately after the surgicalprocedure.Twenty-fourhours afterthe surgicalprocedure blood sampleswere obtained forthe evaluation ofcreatinine，BUN，TNF-α，IL-6 and IL-1β.Ratkidneys were rapidly removed forPAS stain.Western blotwas employed to determine the expression ofNF-κB.ResultsPathologicalchanges ofkidney were induced by sepsisand the levelofcreatinine，BUN，TNF-α，IL-6 and IL-1βwere significantly increased by 178%，66%，55%，114%and 110%（P＜0.01）.respectively；simultaneously the phosphorylation and nuclear expression of NF-κB p65 in kidney tissues were significantly increased by 144%and 102%（P＜0.01）.Sepsis-induced acute kidney injury also significantly reduced the expression of IκBα by 61%（P＜0.01）.These changes were significantly suppressed by early ALA treatment.Compared with C group，the level of creatinine，BUN，TNF-α，IL-6 and IL-1β were significantly decreased by 48%，26%，25%，37%and 40%（P＜0.05），respectively，and the relative expression of IκBα was increased by 103%（P＜0.05）.ConclusionThe present study demonstrated that ALA can suppress the activation of NF-κB，thus ameliorating sepsis-related acute kidney injury.

acute kidney injury；α-lipoic acid；sepsis；NF-κB

R692.5

A

0258-4646（2015）07-0557-04

國家自然科學(xué)基金（81471847）；遼寧省自然科學(xué)基金（2014021003）；沈陽市科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目計(jì)劃（F14-158-9-40）

李國福（1968-），男，教授，博士.

E-mail：ligf@sj-hospital.org

2014-12-15

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：