孫旦芹，宋丹，楊俊偉，何偉春

? 綜述 ?

慢性腎臟病動脈中層鈣化細胞生物學機制研究進展

孫旦芹，宋丹，楊俊偉，何偉春

慢性腎臟?。–KD）是公認的“全球公共健康問題”，我國成人CKD的患病率已達10.8%[1]。隨著腎功能進行性惡化，心血管疾病（CVD）成為CKD患者的主要死亡原因之一，而血管鈣化是其中最常見的病理表現(xiàn)，血管鈣化導致的死亡率約占終末期腎臟?。‥SRD）總病死率的30%左右[2]。動脈中層鈣化是慢性腎臟病患者血管鈣化的主要類型，血管平滑肌細胞（VSMCs）是動脈中層的主要成分，慢性腎臟病的多種危險因素如高磷、高鈣、炎癥等可誘導VSMCs發(fā)生自噬、凋亡及表型改變，對血管鈣化的發(fā)生起了重要作用[3]。本文主要就慢性腎臟病環(huán)境中VSMCs細胞生物學變化在血管鈣化發(fā)生發(fā)展中作用的研究進展作一綜述。

1 慢性腎臟病血管鈣化的病理學特點

血管鈣化主要有兩種病理類型，一種是內膜鈣化，即動脈粥樣硬化，基本病變是動脈內膜的脂質沉積，粥樣斑塊形成，致管壁變硬、管腔狹窄等；另一種是中層鈣化，以羥基磷灰石晶體鈣沿著動脈中層彌漫沉積于整個血管壁為特征，致動脈中層厚度增加，管壁僵硬，順應性降低，這種動脈中層鈣化是慢性腎臟病患者最常見的血管鈣化類型[4]。在鈣化的動脈中層有許多骨相關蛋白的表達，包括骨鈣素（OC）、骨橋蛋白（OP）和骨保護素（OPG），以及多種骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs），它們均參與了動脈的鈣化重塑過程[5]。

2 血管平滑肌細胞的病理改變是慢性腎臟病血管鈣化發(fā)生的關鍵因素

近年來隨著血管鈣化機制研究的不斷深入，目前已知許多因素能夠促進CKD血管鈣化，比如遺傳、高齡、糖尿病、高血壓、吸煙等傳統(tǒng)的因素，非傳統(tǒng)的危險因素包括透析時間、氧化應激、高磷、高鈣、炎癥狀態(tài)及毒素環(huán)境等。在這些影響因素中，CKD患者的血管鈣化與鈣磷調節(jié)紊亂密切相關，高磷、鈣磷乘積升高可直接影響血管平滑肌細胞的功能，從而參與CKD患者心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。

現(xiàn)在公認觀點是，慢性腎臟病患者的血管鈣化并不是簡單的鈣磷沉積的被動過程，而是VSMCs在CKD的環(huán)境中經(jīng)歷凋亡和囊泡形成并向成骨樣細胞表型改變，進而誘導基質形成、合成鈣化蛋白并吸引鈣磷沉積的主動過程[6,7]。超微結構分析也證實，高磷環(huán)境中VSMCs表面出現(xiàn)含有磷灰石的基質囊泡和鈣化的膠原纖維，基質囊泡為鈣化提供晶核形成的位點，與成骨細胞表面芽生的囊泡極為相似[8]。VSMCs的病理改變在慢性腎臟病患者血管鈣化中起關鍵作用。

3 CKD環(huán)境下血管平滑肌細胞的表型改變

3.1 VSMCs表型轉化的特征VSMCs是一種非終末分化細胞，其表型具有可塑性。在高鈣、高磷、高糖、炎癥、氧化應激等的作用下，VSMCs會發(fā)生表型轉化，由主要執(zhí)行舒縮功能的收縮表型轉變?yōu)楹铣杀硇?，獲得合成鈣化相關蛋白的能力，對血管鈣化起關鍵性作用[5,7]。體外實驗表明，高磷環(huán)境能夠使VSMCs丟失平滑肌細胞標志分子如平滑肌22α（SM22α）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）等，干擾VSMCs中的微絲重構并抑制細胞的運動和收縮功能；同時，高磷促使VSMCs表達成骨細胞標志分子Runx2/Cbfα1、Msx2、OSX（osterix）等[6,8]，使細胞向成骨樣細胞表型轉化。Runx2/Cbfα1是一種成骨細胞特異性核轉錄因子，對成骨細胞分化、骨基質基因表達以及骨礦化都是必須的，Yabing et等[9]報道特異性血管平滑肌細胞Runx2基因敲除的小鼠能部分抑制血管鈣化；Msx2基因是同源基因Msh家族成員，在骨形成和成骨細胞分化過程中發(fā)揮重要作用，Msx2的大量表達可以引起下游的另一個骨轉錄因子OSX表達增加；OSX是由Nakashima等[10]發(fā)現(xiàn)的成骨細胞分化終末期的一種重要的特異性轉錄因子，只在發(fā)育的骨組織中特異性表達，是骨礦化過程中所必需的轉錄因子，OSX自身的突變或缺失也可導致骨礦化的遲滯或停止。這些成骨細胞核特異性轉錄因子在VSMCs中的表達增加后可促進許多骨基質成分的表達，如I型膠原、OC、OP以及堿性磷酸酶（ALP）等的表達。I型膠原能夠促進鈣化結節(jié)的形成加速，增加鈣的侵入，OC和OP均是骨基質中調節(jié)礦化的非膠原蛋白，而ALP是早期調節(jié)骨礦化的關鍵酶，其升高提示存在高的骨形成率[5]。這些基質蛋白表達增加后可作為其后礦化的核心，使鈣鹽和骨基質蛋白沉積于動脈中層（圖1）。

3.2 高磷誘導VSMCs表型轉化的機制臨床研究證實，循環(huán)中高磷是血管鈣化的一個獨立危險因素，當血清磷高于6.5 mg/dl時能夠顯著地增加心血管事件的風險，并增加ESRD患者的死亡率[11]。動物實驗表明[12]，7/8腎切除CKD小鼠飼以高磷飲食8周后，主動脈中層有鈣鹽沉積。

體外研究發(fā)現(xiàn)[13]，無機磷（P的濃度＞1.4mmol/L）對VSMCs周圍基質礦化具有劑量依賴性。此種效應依賴于細胞外高磷能夠激活VSMCs細胞膜上的III型鈉-磷協(xié)同轉運通道（NPC）中的Pit-1，增加磷在細胞內的水平，繼而誘導Runx2/Cbfα1等核轉錄因子的表達，啟動血管鈣化過程的發(fā)生。當將NPC抑制劑磷甲酸（PFA）與VSMCs共培養(yǎng)時，VSMCs對細胞外磷的攝取受到抑制，進入細胞內的磷減少，繼而影響Runx2/Cbfα1表達的啟動，從而預防鈣化的發(fā)生。近期研究表明[14]，高磷環(huán)境下的VSMCs以及高磷飲食的尿毒癥大鼠主動脈組織中，Klf4因子的mRNA及蛋白的表達明顯增高，進一步研究發(fā)現(xiàn)VSMCs中的Klf4因子在高磷誘導下能夠結合到骨轉錄因子的啟動子區(qū)域，調節(jié)VSMCs成骨基因的轉錄，促進成骨細胞相關蛋白表達增加。因此，在高磷環(huán)境下，經(jīng)過膜通道轉運進入VSMCs內的磷通過啟動成骨細胞轉錄因子表達促使VSMCs向成骨樣表型轉化。

圖1 動脈中層鈣化的發(fā)生過程

關于高磷如何啟動和調控VSMCs成骨調節(jié)和生物礦化程序的關鍵細胞內信號途徑，目前僅有部分報道。我們研究發(fā)現(xiàn)高磷能夠活化VSMCs內轉化生長因子（TGF）-β，并上調其I型受體（TβRI）的表達，TGF-β1的中和抗體能明顯拮抗高磷對VSMCs的生物學效應，提示TGF-β1直接介導了細胞的表型轉化過程[15]。Julio M等證實在培養(yǎng)的VSMCs中，高磷通過活化Wnt/β-catenin信號通路增加Runx2/ Cbfα1表達，促進VSMCs向成骨樣細胞表型轉化；而活化帕立骨化醇通過抑制VSMCs內Wnt/β-catenin信號通路的活化，抑制高磷誘導的Runx2表達從而阻止細胞表型轉化[16]。體內研究表明[12]，在高磷飲食誘導尿毒癥大鼠血管鈣化的晚期，分析主動脈組織中的基因發(fā)現(xiàn)，Wnt拮抗劑——分泌性Frizzled相關蛋白1、2、4（sFRP1、sFRP2和sFRP4）均上調，表面上看這似乎與以往認為的Wnt信號促進鈣化的觀點相矛盾，然而它也提示，升高的sFRPs很可能是防御機制的一種表現(xiàn)，目的是減弱或阻斷過度活躍的Wnt信號，進而減少動脈壁的礦化以避免血管鈣化的進一步發(fā)展。近期一項研究[17]發(fā)現(xiàn)高磷可以通過增加線粒體膜電位而促進線粒體活性氧（ROS）的產(chǎn)生增加，進而活化致炎轉錄因子NF-κB信號通路，促進收縮表型的VSMCs向成骨樣細胞表型轉化，促進血管鈣化的發(fā)生。此外，ERK信號通路、P38/MAPK信號通路也參與磷所誘導VSMCs表型轉化的過程，具體機制有待進一步闡明[18]。

3.3 VSMCs表型轉化的抑制因素在CKD環(huán)境下促鈣化動力因素與抑制鈣化因素不平衡的綜合結果也是血管鈣化發(fā)生的原因之一。促進鈣化因素有：年齡、鈣磷代謝紊亂、糖尿病、炎癥以及透析年齡等。抑制因素有：胎球蛋白（Fetuin A）、基質GLA蛋白（MGP）、骨保護素（OPG）、骨形成蛋白-7（BMP-7）、焦磷酸鹽、骨橋蛋白等。其中Fetuin A、MGP以及OPG等不僅能抑制鈣磷沉積還能抑制VSMCs表型轉化[5]。Fetuin A是一種糖化蛋白，主要由肝臟合成和分泌進入循環(huán)，聚集于骨骼中，為細胞外鈣調節(jié)蛋白，能與鈣磷形成高分子量復合物，抑制過飽和的鈣磷鹽沉積；此外，F(xiàn)etuin A分子的氨基末端存在與TGF-β II受體相似的序列，可與TGF-β結合抑制VSMCs向成骨樣細胞轉分化，避免鈣化進展。Ketteler等[19]報道尿毒癥患者血清Fetuin A普遍降低的，且低Fetuin A與透析患者心血管死亡率和全因死亡率增加相關。MGP在血管中主要由VSMCs 產(chǎn)生的細胞外基質蛋白，含有5個維生素K依賴性的谷氨酸殘基，是一種維生素K依賴性蛋白。維生素K能促使MGP的谷氨酸殘基轉變成羧基化谷氨酸殘基，羧基化能使MGP蛋白發(fā)揮生理活性，抑制VSMCs的表型轉化，并且抑制VSMCs與基質囊泡的鈣鹽相結合，從而抑制血管鈣化進展。華法林是雙香豆素類，能夠抑制維生素K環(huán)氧化物還原酶的活性從而阻斷還原型維生素K的生成，影響MGP羧基化反應；尿毒癥大鼠應用治療劑量華法林后能夠顯著減少體內MGP水平并加重大動脈鈣化[20]。OPG是腫瘤壞死因子受體超家族成員，不但能抑制VSMCs表型轉化，還能夠抑制動脈組織ALP活性，抑制鈣化進展[2,4,5]。隨著慢性腎臟病的進展，營養(yǎng)狀況、鈣磷紊亂、炎癥狀態(tài)等情況加重，這些鈣化抑制蛋白消耗增多和表達不斷下降。因此，促進VSMCs表型轉化因素的增強與細胞主動防御機制的削弱導致慢性腎臟病患者的血管鈣化進行性加重。

4 血管平滑肌細胞的凋亡

基質囊泡是由增殖的軟骨細胞或骨細胞漿膜形成的獨立于細胞外的細胞器。基質囊泡的膜富含類脂并具有很高的ALP活性，可水解基質中多種磷酸酯，使無機磷濃度升高；囊泡中富含絲氨酸磷酯，具有富集鈣離子生成無定形磷酸鈣并進一步轉化為磷灰石的作用。胚胎骨、軟骨及牙本質中的礦物都是通過基質囊泡在細胞外形成的。

近來研究發(fā)現(xiàn)，VSMCs發(fā)生凋亡或壞死后的降解產(chǎn)物—基質囊泡，是血管鈣化的始動環(huán)節(jié)或起始點[21,22]。VSMCs來源的基質囊泡是礦化競爭的一種方式，目的是減少細胞內過多的鈣負荷帶來的細胞毒性損傷，在正常機體血管壁中，這些囊泡會被吞噬細胞及時吞噬并降解，不會引起動脈中層礦化。但在CKD狀態(tài)下，各種致鈣化因素的刺激導致VSMCs受損后，含有很高ALP活性的囊泡從活的或者即將死亡的VSMCs中釋出，形成堿性鈣磷沉積的微環(huán)境，增加羥基磷灰石沉積，同時基質囊泡還能結合細胞外的基質蛋白如OC、OP、I型膠原等從而啟動血管鈣化過程[23,24]。

Shroff RC等[25]報道透析相關因素如血流動力學改變等會增加患者血管壁VSMCs凋亡，凋亡小體形成后使得這些部位血管壁ALP活性明顯增高形成易于鈣化沉積微環(huán)境，囊泡增多后還可以富集大量鈣離子，高鈣反過來又加重細胞凋亡，并減少基質囊泡中鈣抑制物如MGP和Fetuin-a 的水平，如此惡性循環(huán)加重血管鈣化。體外研究表明[26]，在培養(yǎng)的人VSMCs中，高磷能夠影響VSMCs線粒體的代謝途徑從而促進VSMCs凋亡；而HMG-CoA抑制劑他汀類藥物能夠緩解高磷所誘導的凋亡從而部分抑制鈣化。臨床研究顯示，透析后患者橈動脈中膜存在VSMCs凋亡小體，且凋亡發(fā)生在血管鈣化之前，用他汀類藥物干預后能夠抑制凋亡并緩解鈣化程度[5,19]。因此，高磷、高鈣、血液透析都能誘導細胞凋亡并加重血管鈣化，但具體機制還有待進一步研究。

5 血管平滑肌細胞的自噬

自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，是真核細胞特有的生命現(xiàn)象。它是對外源性刺激（營養(yǎng)缺乏、低氧、氧化應激、感染等）的適應性反應，可作為一種防御機制清除受損的細胞器以及代謝產(chǎn)物等，它作為一種細胞死亡程序誘導細胞主動性死亡[27]。

有關VSMCs自噬參與血管鈣化的報道還比較少。Somers P等發(fā)現(xiàn)早期主動脈瓣退行性變時，平滑肌細胞發(fā)生自體吞噬死亡后會釋放很多基質囊泡，并趨化炎癥因子，啟動鈣化程序。而近期王憲等報道，用3-MA以及Atg5 siRNA等自噬抑制物能夠增加高磷所誘導的人VSMCs的鈣化，用VPA等自噬刺激物反而緩解VSMCs鈣鹽沉積。體內實驗腺嘌呤所誘導的CKD大鼠血管鈣化的實驗數(shù)據(jù)也證實了自噬能夠部分緩解高磷所誘導的大動脈中層鈣化。研究者[29]認為VSMCs的自噬能自身部分拮抗磷所誘導的血管鈣化。因此，適當?shù)淖允珊芸赡苁荲SMCs應對高磷等致鈣化因素的一種細胞自我保護性機制，而過多自噬則可能導致細胞的死亡。VSMCs自噬與血管鈣化的關系仍有很大爭議，待進一步研究來闡明。

綜上所述，動脈的中層血管鈣化是引起慢性腎臟病患者心血管事件高發(fā)的重要因素，其中，VSMCs的病理改變是慢性腎臟病血管鈣化的核心問題。多種機制，如凋亡、自噬、表型改變等均參與了CKD血管鈣化的進展，隨著對VSMCs凋亡、自噬、表型轉化等調控作用和分子機制研究的不斷深入，對CKD患者血管鈣化的防治可提供新的思路以及新靶點，對于降低心血管事件死亡風險，改善患者預后具有重要意義。

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R543.5

A

1674-4055(2015)04-0563-03

2015-04-08）

（責任編輯：張靈）

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