劉士甫，趙 磊，康書(shū)慧，高 偉，曹金鳳，張 鑫，杜君曉

(河北省石家莊市第五醫(yī)院，河北 石家莊 050024)

菌陽(yáng)肺結(jié)核患者外周血T細(xì)胞亞群的變化及意義

劉士甫，趙 磊，康書(shū)慧，高 偉，曹金鳳，張 鑫，杜君曉

(河北省石家莊市第五醫(yī)院，河北 石家莊 050024)

目的 探討初治菌陽(yáng)性肺結(jié)核患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化及其對(duì)免疫狀態(tài)的作用。方法 選取2013—2014年初治活動(dòng)性肺結(jié)核患者50例作為觀察組，另外選擇50例同期健康體檢者作為健康對(duì)照組，對(duì)比2組患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+水平。結(jié)果 痰菌陽(yáng)性肺結(jié)核患者外周血CD3+、CD4+以及CD3+/CD4+水平顯著低于健康體檢者；結(jié)核抗體陽(yáng)性患者CD3+、CD4+以及CD3+/CD4+水平明顯低于陰性患者；CD3+、CD4+、CD8+水平與病變累及范圍大小無(wú)關(guān)。結(jié)論 外周血T淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)能夠明顯反映人體的免疫系統(tǒng)情況，可以作為菌陽(yáng)肺結(jié)核病情變化的參考值，具有一定的臨床價(jià)值。

菌陽(yáng)；肺結(jié)核；外周血；T細(xì)胞亞群

結(jié)核病的免疫機(jī)制較為復(fù)雜，結(jié)核病患者在受到結(jié)核桿菌的侵入之后，會(huì)產(chǎn)生一系列的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)，而在我國(guó)的臨床研究中關(guān)于肺結(jié)核的免疫組織化學(xué)研究較少[1]。結(jié)核病主要免疫反應(yīng)為T(mén)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，淋巴細(xì)胞在結(jié)核免疫中的作用十分重要。肺結(jié)核的疾病發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸與結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量與毒力相關(guān)，同時(shí)也與患者的細(xì)胞免疫功能存在直接的關(guān)系[2]。外周血淋巴細(xì)胞亞群是能夠直接反映人體免疫功能的重要指標(biāo)。本研究以流式細(xì)胞檢測(cè)方式對(duì)初治活動(dòng)性菌陽(yáng)性肺結(jié)核患者與健康人群T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行分析，分別分析CD3+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞水平，以及肺結(jié)核患者不同角度的T淋巴細(xì)胞亞群變化。

1 臨床資料

1.1一般資料 選取2013—2014年在我院住院治療的痰菌陽(yáng)性初治肺結(jié)核患者50例作為觀察組，均為活動(dòng)性初診肺結(jié)核且未給予抗結(jié)核治療方案治療，診斷標(biāo)準(zhǔn)以2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)制定的《肺結(jié)核診斷與治療指南》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)[3]。觀察組50例患者均為男性，年齡19～47(30.5±11.7)歲，行痰液涂片、痰液培養(yǎng)以及纖維支氣管鏡刷檢發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌，均排除腫瘤等免疫系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)先關(guān)疾病，HIV抗體均為陰性，4個(gè)月內(nèi)沒(méi)有應(yīng)用激素治療或免疫抑制劑治療。另選取我院同期行健康體檢的受檢者50例作為健康對(duì)照組，受檢者均為男性，年齡18～45(30.1±10.4)歲，均不存在代謝系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)疾病。2組患者一般資料組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 研究方法 儀器選擇為美國(guó)BD公司生產(chǎn)的FACSCalibur四色流式細(xì)胞儀，試劑盒選擇MultiTEST IMK Kit試劑盒。在治療前與治療后2個(gè)月抽取患者外周血，均在清晨抽取空腹血，以肝素抗凝試管保存，抗凝藥物選擇乙二胺四乙酸(EDTA)。將10 μL的CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP/CD4 aPC與10 μL的3FITC/CD16PE+56PE/CD45PerCP/CD19 aPC分別鍵入2個(gè)流式細(xì)胞檢測(cè)試劑管的底部，管中分別鍵入抗凝血與單克隆抗體，充分混合均勻。在常溫以及避光的環(huán)境下染色15 min。裂解紅細(xì)胞后，以流式細(xì)胞儀分析熒光抗體染色后，進(jìn)行上機(jī)檢驗(yàn)，獲取細(xì)胞數(shù)在15 000以上。以美國(guó)BD工期的MULTISET軟件進(jìn)行分析，獲得淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞，計(jì)算CD4+/CD8+比值。

2 結(jié) 果

2.1肺結(jié)核與健康人群T淋巴細(xì)胞亞群比較 肺結(jié)核組患者T淋巴細(xì)胞亞群中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均明顯低于健康對(duì)照組(P均<0.05)，CD8+水平與健康對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 觀察組結(jié)核抗體與T細(xì)胞亞群比較 觀察組結(jié)核抗體陽(yáng)性患者T淋巴細(xì)胞亞群中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均明顯低于結(jié)核抗體陰性患者(P均<0.05)，CD8+水平與結(jié)核抗體陰性患者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 觀察組病變范圍與T淋巴細(xì)胞亞群關(guān)系 觀察組病變范圍在3肺野以上患者與低于3肺野患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表3。

表1 2組T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較

表2 觀察組結(jié)核抗體陰性與陽(yáng)性患者T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果比較

表3 肺結(jié)核病變累及范圍與T淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系比較

3 討 論

結(jié)核桿菌主要通過(guò)呼吸道、消化道和損傷的皮膚侵入易感機(jī)體，能引起多種組織器官的結(jié)核病。其中以通過(guò)呼吸道引起的肺結(jié)核為最多見(jiàn)，感染結(jié)核菌的數(shù)量、毒力、次數(shù)和感染者的免疫狀態(tài)也各有不同。結(jié)核菌經(jīng)淋巴管擴(kuò)散至肺門(mén)淋巴結(jié)，在其中繁殖，引起肺門(mén)淋巴結(jié)腫大，稱(chēng)為原發(fā)綜合征。經(jīng)過(guò)3～6周，宿主產(chǎn)生了針對(duì)結(jié)核菌的特異性細(xì)胞免疫(當(dāng)然也產(chǎn)生了遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng))，從而增加了宿主的抵抗力，于是局部病灶逐漸被增殖性病變所代替[4]。病灶以干酪物質(zhì)和多核巨細(xì)胞及類(lèi)上皮細(xì)胞為核心，周?chē)性S多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，外繞以網(wǎng)狀纖維，形成結(jié)核結(jié)節(jié)。成年人多見(jiàn)繼發(fā)性感染或稱(chēng)原發(fā)后感染，病灶以肺部為多見(jiàn)[5]。致病的結(jié)核菌可以是潛伏于原發(fā)感染灶內(nèi)的(內(nèi)源性感染)，或從外界再次吸入的(外源性感染)。由于機(jī)體已形成對(duì)結(jié)核菌的特異性免疫，故對(duì)再次侵入的結(jié)核菌有較強(qiáng)的包圍能力，因此病灶常局限化，被纖維囊壁包圍的干酪樣壞死灶可鈣化而達(dá)痊愈[6]。

T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能是由T淋巴細(xì)胞亞群完成的，結(jié)核病的免疫功能是由T細(xì)胞作為遞質(zhì)的細(xì)胞免疫反應(yīng)為主的。T淋巴細(xì)胞亞群中根據(jù)細(xì)胞表面的分子特征以及功能的不同主要分為4個(gè)亞群，分別為殺傷性細(xì)胞(Tc)、誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞(Ti/Th)、抑制性T細(xì)胞(Ts)與遲發(fā)型超敏反應(yīng)T細(xì)胞[7]。CD3是T淋巴細(xì)胞均有的表面共同標(biāo)志物，而CD4是Ti/Th細(xì)胞的表面標(biāo)志物，CD8是Ts細(xì)胞的表面標(biāo)志物[8]。CD4+/CD8+的比值能夠反映Th細(xì)胞與Ts細(xì)胞之間的功能平衡狀態(tài)。有臨床研究表明，T淋巴細(xì)胞的平衡狀態(tài)對(duì)結(jié)核病的發(fā)生與發(fā)展有明顯的影響，當(dāng)CD4與CD8細(xì)胞的數(shù)量或功能存在異常，T淋巴細(xì)胞的調(diào)節(jié)功能平衡就會(huì)失去，從而引發(fā)疾病[9]。CD3是T淋巴細(xì)胞識(shí)別抗原的主要單位，而結(jié)核病屬于遲發(fā)性超敏反應(yīng)，結(jié)核桿菌抗原刺激了T淋巴細(xì)胞的激活、趨化與增生過(guò)程，可能引發(fā)病變局部的T淋巴細(xì)胞數(shù)量增加[10]。說(shuō)明結(jié)核病的免疫功能與T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能相關(guān)，而T淋巴細(xì)胞在結(jié)核病免疫機(jī)制中具有核心作用。

當(dāng)前抗結(jié)核臨床研究中T淋巴細(xì)胞已經(jīng)成為熱點(diǎn)，而在肺結(jié)核組織中的種類(lèi)與數(shù)量研究在我國(guó)還不多見(jiàn)。本次臨床研究中，對(duì)初治涂陽(yáng)性肺結(jié)核患者的T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明初治菌陽(yáng)性肺結(jié)核患者外周血中的T淋巴細(xì)胞亞群CD3+與CD4+均明顯低于正常人群，而CD8+水平與健康人群比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而CD4+/CD8+的比值相比健康人群比較顯著降低。這樣的結(jié)果說(shuō)明初治菌陽(yáng)性肺結(jié)核患者的外周血液中，T淋巴細(xì)胞亞群均存在一定程度的減少，主要表現(xiàn)為CD4+與CD3+T淋巴細(xì)胞減少，同時(shí)CD4+與CD8+細(xì)胞的平衡失調(diào)，因此肺結(jié)核患者存在以T淋巴細(xì)胞亞群CD4+明顯減少為特征的淋巴細(xì)胞免疫缺陷，與其他臨床研究的結(jié)果一致[11]。結(jié)核菌菌體抗原導(dǎo)致大量CD4+與CD8+淋巴細(xì)胞靠近病變位置，減少了外周血液中的CD4+細(xì)胞，而受影響的CD4+細(xì)胞數(shù)量相比CD8+細(xì)胞更多，從而使得CD4+/CD8+比值的明顯降低[12]。同時(shí)也證明了肺結(jié)核患者T淋巴細(xì)胞存在變化失衡的狀態(tài)，可能引發(fā)肺結(jié)核疾病的發(fā)生與發(fā)展。

而本次臨床研究中，對(duì)結(jié)核桿菌抗體以及病變范圍影響下患者外周血T淋巴細(xì)胞的亞群變化進(jìn)行分析。結(jié)果表明，結(jié)核桿菌抗體為陽(yáng)性的患者外周血T淋巴細(xì)胞中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均明顯低于結(jié)核抗體陰性的患者。當(dāng)前臨床研究中的主流觀點(diǎn)認(rèn)為，T淋巴細(xì)胞CD4+的減少主要有2個(gè)因素：第一個(gè)因素，CD4+細(xì)胞減少的原因是機(jī)體內(nèi)部調(diào)節(jié)機(jī)制所致，淋巴細(xì)胞向病灶位置聚集。肺結(jié)核患者的支氣管肺泡灌洗液中CD4+與CD4+/CD8+比值均明顯高于正常人與肺癌患者，說(shuō)明T淋巴細(xì)胞中CD4+減少與T淋巴細(xì)胞聚集在病灶位置相關(guān)，并非患者體內(nèi)CD4+細(xì)胞絕對(duì)值減少，屬于假性的外周血液水平降低。而第二個(gè)因素就是T淋巴細(xì)胞CD4+的真性減少，也就是說(shuō)患者體內(nèi)CD4+整體數(shù)量的減少。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，小鼠應(yīng)用大劑量的抗原過(guò)程中可能引發(fā)抑制性T淋巴細(xì)胞的升高[13]。所以，在結(jié)核桿菌一次性大量進(jìn)入人體或大量繁殖的過(guò)程中，外周血可能存在抑制性T淋巴細(xì)胞的增多，從而對(duì)患者機(jī)體免疫功能起到抑制作用，減少患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞CD3+與CD4+亞群。而同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)[14]，營(yíng)養(yǎng)不良、白細(xì)胞介素-2分泌減少、HIV病毒感染以及單核細(xì)胞的抑制功能與T淋巴細(xì)胞的趨化性缺陷均可能成為影響因素。而在病變累及范圍的研究結(jié)果中，病變累及范圍在3肺野以上與3肺野以下患者的T淋巴細(xì)胞各個(gè)亞群均不存在顯著變化，提示初治活動(dòng)性肺結(jié)核中疾病發(fā)展程度與T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量并不存在直接的相關(guān)性。

肺結(jié)核疾病的免疫過(guò)程是肺結(jié)核病菌與患者免疫系統(tǒng)反應(yīng)長(zhǎng)期斗爭(zhēng)的慢性發(fā)展過(guò)程，致病結(jié)核菌在誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)應(yīng)答的過(guò)程中抵抗患者免疫系統(tǒng)清除能力。在結(jié)核菌最初被發(fā)現(xiàn)時(shí)就已經(jīng)被確定細(xì)菌并不是結(jié)核病發(fā)生與發(fā)展的所有原因，與其他細(xì)菌性疾病的發(fā)病機(jī)制相比，結(jié)核性疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中宿主的自身因素更加重要。T細(xì)胞亞群與巨噬細(xì)胞均在控制肺結(jié)核桿菌生長(zhǎng)與繁殖中具有重要的作用。對(duì)結(jié)核患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行探討研究，能夠?qū)Y(jié)核桿菌發(fā)生、繁殖以及疾病轉(zhuǎn)歸有重要的意義，能夠?yàn)榻Y(jié)核性疾病的發(fā)病機(jī)制與免疫機(jī)制提供有力證明，也為免疫干預(yù)提供重要的依據(jù)。本次臨床研究結(jié)果顯示，外周血液T淋巴細(xì)胞亞群能夠作為菌陽(yáng)肺結(jié)核的有效標(biāo)志物，但無(wú)法對(duì)疾病程度進(jìn)行有效標(biāo)識(shí)。

[1] 陳廷,聶尚丹,趙月霞，等. 肺結(jié)核患者細(xì)胞免疫功能與CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡相關(guān)性研究[J]. 中國(guó)醫(yī)師雜志,2011,13(12):1595-1598

[2] 周曉映,于紅艷,原淑鴻，等. 老年肺結(jié)核患者外周血中T淋巴細(xì)胞亞群和NK細(xì)胞的改變及臨床意義[J]. 河北醫(yī)藥,2009,31(2):169

[3] 張培元. 肺結(jié)核診斷和治療指南[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志,2001,24(2):70-74

[4] 祁燕偉,白勁松,萬(wàn)榮，等. T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在人類(lèi)免疫缺陷病毒合并肺結(jié)核感染中不同T細(xì)胞水平臨床診斷價(jià)值[J]. 昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,32(9):63-67

[5] 彭德虎,謝貝,孟繁榮，等. 初治肺結(jié)核患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)分析[J]. 現(xiàn)代醫(yī)院,2011,11(7):10-13

[6] 林小田,謝媛琪,王昱，等. 肺結(jié)核病患者外周血前炎性因子及細(xì)胞亞群凋亡的研究[J]. 華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志,2009,23(5):1-4

[7] 翟慧,劉一典,唐神結(jié)，等. 肺結(jié)核患者外周血NKT細(xì)胞、NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群的變化及意義[J]. 同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2010,31(5):42-46

[8] Chaitra MG,Shaila MS,Nayak R，et al. Detection of interferon gamma-secreting CD8(+) T lymphocytes in humans specific for three PE/PPE proteins of Mycobacterium tuberculosis[J]. Micr Infect,2008,10(8):858-867

[9] Bruns H,Meinken C,Schauenberg P，et al. Anti-TNF immunotherapy reduces CD8+T cell-mediated antimicrobial activity against Mycobacterium tuberculosis in humans[J]. J Clin Invest,2009,119(5):1167-1177

[10] 楊妍,唐神結(jié),張青，等. 耐多藥和廣泛耐藥肺結(jié)核患者外周血中免疫細(xì)胞的表達(dá)及其意義[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志,2011,34(2):109-113

[11] 胥萍. 肺結(jié)核患者外周淋巴細(xì)胞亞群及協(xié)同刺激分子PD-1/PD-L1的表達(dá)特性與生物學(xué)意義[D]. 蘇州：蘇州大學(xué),2012

[12] Chee CB,Barkham TM,Khinmar KW，et al. Quantitative T-cell interferon-gamma responses to Mycobacterium tuberculosis-specific antigens in active and latent tuberculosis[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2009,28(6):667-670

[13] 黃惠安，賴(lài)曉宇，劉桂芬，等. 老年肺結(jié)核患者細(xì)胞、體液及紅細(xì)胞免疫狀態(tài)的變化研究[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,22(24):2691-2693

[14] 張少俊,肖和平. 復(fù)治肺結(jié)核與初治結(jié)核病患者外周血T細(xì)胞亞群等的變化及其意義[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志,2011,34(12):884-887

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.21.030

R521

B

1008-8849(2015)21-2360-03

2014-07-10