梁 青,李凱麗,劉尚勤

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院，湖北 武漢 430071)

VDAC1基因在多發(fā)性骨髓瘤患者中表達(dá)的研究

梁 青,李凱麗,劉尚勤

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院，湖北 武漢 430071)

目的 研究線粒體電壓依賴性陰離子通道1(VDAC1)在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達(dá)情況及其與骨髓瘤細(xì)胞代謝和凋亡的關(guān)系。方法 選擇多發(fā)性骨髓瘤患者20例作為觀察組，非腫瘤患者10例作為對照組。采用RT-PCR方法檢測2組骨髓標(biāo)本單個核細(xì)胞中VDAC1基因的表達(dá)情況。結(jié)果 觀察組VDAC1基因表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.05)；觀察組中Ⅲ期患者VDAC1基因表達(dá)量明顯高于Ⅰ期及Ⅱ期患者(P均<0.05)，Ⅱ期患者高于Ⅰ期患者(P<0.05)。結(jié)論 多發(fā)性骨髓瘤患者VDAC1高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞高代謝相關(guān)，對腫瘤細(xì)胞凋亡起到重要作用。VDAC1將為多發(fā)性骨髓瘤的治療提供新的方向。

線粒體電壓依賴性陰離子通道1；多發(fā)性骨髓瘤；基因表達(dá)

電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel，VDAC1)位于所有真核生物線粒體外膜上，是一種線粒體外膜上的孔型蛋白[1]。VDAC1在ATP和ADP的跨線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起著關(guān)鍵作用[2]。目前認(rèn)為，線粒體依賴性細(xì)胞凋亡與多種疾病有關(guān)，如神經(jīng)變性疾病、腫瘤、心血管疾病等[3]。筆者在前期實(shí)驗(yàn)中觀察到，通過改變VDAC1在細(xì)胞中的表達(dá)，骨髓瘤細(xì)胞株的線粒體跨膜電壓、藥物敏感性以及凋亡均出現(xiàn)改變。由此，本研究對VDAC1在多發(fā)性骨髓瘤(multiple myelom,MM)患者體內(nèi)的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，以探討其與腫瘤細(xì)胞代謝、凋亡的關(guān)系。

1 研究資料

1.1 材料 選取2014年3月—2015年2月于我院血液科就診，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、流式免疫分型、染色體、分子遺傳學(xué)診斷為多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓標(biāo)本20例作為觀察組，男12例，女8例；年齡47～74歲，中位年齡60歲；根據(jù)國際分期系統(tǒng)(international staging system，ISS)[4]分為3期：Ⅰ期6例，Ⅱ期6例，Ⅲ期8例。選取同期住院10例非腫瘤患者骨髓樣本作為對照組，男6例，女4例；年齡40～70歲，中位年齡56歲。2組性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。

1.2 主要試劑與儀器 淋巴細(xì)胞分離液Ficol來自于GE公司，TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix購自Fermentas公司，Ex Taq、DL2000 DNA Marker來自于寶生物工程TAKARA公司。PCR儀為東勝創(chuàng)新生物科技有限公司產(chǎn)品，實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 單個核細(xì)胞分離、總RNA提取與cDNA合成 取EDTA-K3抗凝的骨髓標(biāo)本3 mL利用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液梯度離心，分離出單個核細(xì)胞。應(yīng)用TRIzol、按照常規(guī)方法提取RNA：收集細(xì)胞，加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞;加入200 μL氯仿，輕輕顛倒數(shù)次混勻，室溫放置5 min;4 ℃ 12 000 r/min離心15 min;轉(zhuǎn)上層水相(約400 μL)于新1.5 mL EP管中，加入400 μL異丙醇，混勻，室溫靜置10 min、4 ℃ 12 000 r/min離心10 min;棄上清，沉淀用預(yù)冷的70%無水乙醇洗3次，空氣干燥5～10 min，溶于20 μL DEPC水中;分光光度計測定RNA濃度。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.3.2 引物設(shè)計 根據(jù)VDAC1基因mRNA序列設(shè)計引物(NM-)，選取保守區(qū)，設(shè)計并合成特異性引物，以人β-actin基因?yàn)閮?nèi)參對照。VDAC1引物序列為Homo VDAC1F: 5’- GCAGGAAACAGTAACACG -3’ ,Homo VDAC1 R:5’- AACCTATCAGGCTGGAGT -3’，擴(kuò)增目的產(chǎn)物的片段長度為100 bp，內(nèi)參對照β-actin的序列為 Homo β-actin F：5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’ ,Homo β-actin R：5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’,β-actin全長為258 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計并合成。

1.3.3 PCR與定量分析 利用SYBR Green/Flourescein實(shí)時熒光定量PCR方法檢測外周血單個核細(xì)胞VDAC1基因的表達(dá)情況。使用ABI實(shí)時定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR：cDNA(10×稀釋) 4 μL，PCR Forward Primer (100 μmol/L) 0.4 μL，PCR Reverse Primer (100 μmol/L)0.4 μL，SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix(2×)10 μL，H2O 5.2 μL。循環(huán)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s;然后95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，循環(huán)反應(yīng)40次，并進(jìn)行溶解曲線的獲取。配置2%瓊脂糖凝膠，取5 μL PCR產(chǎn)物電泳。采用相對定量法分析2組VDAC1基因表達(dá)水平的差異。相對定量公式為：2-ΔΔCT，ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對照組。

2 結(jié) 果

2.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增特異性 目的基因VDAC1及內(nèi)參對照β-actin的溶解曲線見圖1及圖2，均呈單峰。VDAC1的溶解溫度為84.07 ℃，β-actin溶解溫度為87.65 ℃，并隨機(jī)取樣本于2%瓊脂糖凝膠電泳分析提示VDAC1的PCR片段為100 bp。

圖1 目的基因VDAC1 PCR產(chǎn)物溶解曲線

2.2 2組VDAC1基因相對表達(dá)量比較 2組骨髓標(biāo)本中VDAC1基因表達(dá)電泳結(jié)果見圖3。觀察組VDAC1基因mRNA相對表達(dá)量為38.478±47.891，對照組為4.963±4.523，觀察組表達(dá)量明顯高于對照組(t=-2.501，P<0.05)。

圖2 內(nèi)參對照β-actin PCR產(chǎn)物溶解曲線

1為Marker；2～7為觀察組；8～10為對照組。圖3 2組2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 VDAC1基因在多發(fā)性骨髓瘤不同分期中的表達(dá)量 Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者VDAC1基因表達(dá)量分別為8.567±4.063，19.364±14.742，75.248±44.396。Ⅲ期患者VDAC1基因表達(dá)量明顯高于Ⅰ期、Ⅱ期患者(P均<0.05)，Ⅱ期患者高于Ⅰ期患者(P<0.05)。

3 討 論

VDAC蛋白是構(gòu)成滲透性轉(zhuǎn)換孔(permeability transition pore，PTP)的重要組成部分，位于線粒體外膜的VDAC與位于內(nèi)膜的腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(adenine nucleotide translocator，ANT)和位于基質(zhì)的環(huán)孢素A受體D(cyclophilin-D，Cyp-D)共同組成了線粒體PTP。現(xiàn)普遍認(rèn)為PTP的高通透性開放是引發(fā)細(xì)胞死亡，尤其是凋亡的關(guān)鍵[5]。生理條件下，PTP呈低通透性、可逆地開放，而在病理條件下，PTP呈高通透性開放狀態(tài)，引起線粒體腫脹、膜電位下降以及細(xì)胞色素C等的釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。而VDAC作為線粒體PTP的主要成分，成為啟動線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡的重要因素[6]。

本研究結(jié)果顯示，VDAC1基因在多發(fā)性骨髓瘤患者體內(nèi)表達(dá)明顯增加。由此推測骨髓瘤細(xì)胞的產(chǎn)生過程中存在VDAC1基因的過度表達(dá)，考慮腫瘤細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展過程中，由于不斷增殖，惡性腫瘤細(xì)胞糖酵解反應(yīng)增加，糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一己糖激酶(hexokinase，HK)會出現(xiàn)高表達(dá)，而HK具有凋亡抑制效應(yīng)[7]，但HK的增加會導(dǎo)致VDAC1的上調(diào)，足夠數(shù)量的VDAC1才能與HK相互結(jié)合，發(fā)揮抗凋亡的作用，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞繼續(xù)增殖[8]。根據(jù)國際分期系統(tǒng)，多發(fā)性骨髓瘤Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ期患者的中位生存時間分別為62個月、44個月及29個月。本研究結(jié)果顯示Ⅲ期患者VDAC1的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，進(jìn)一步表明VDAC1的高表達(dá)可加速腫瘤細(xì)胞生長，甚至加速疾病進(jìn)展，從而影響了患者的預(yù)后和生存時間。

線粒體凋亡途徑是許多化療藥物消滅腫瘤細(xì)胞的重要機(jī)制之一。VDAC1作為線粒體膜孔道蛋白的重要組成部分，一些理化因素如化學(xué)物、病毒等刺激可使VDAC的結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生異常，導(dǎo)致線粒體能量代謝紊亂[9]；許多藥物如抗腫瘤、腦神經(jīng)藥物等可以VDAC為藥物靶點(diǎn)，發(fā)揮其治療效應(yīng)；而一些細(xì)胞內(nèi)因子如Bcl-2、bax等亦可與VDAC發(fā)生相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或抑制細(xì)胞凋亡[10-11]。因此，VDAC1的表達(dá)水平改變可以為腫瘤生物治療提供新的方向。以VDAC1為基礎(chǔ)的生物治療，如VDAC1活性抑制劑或是降低與VDAC1結(jié)合的競爭性藥物會對高表達(dá)VDAC1的腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生良好的療效[12]。

綜上所述，VDAC1在多發(fā)性骨髓瘤患者中出現(xiàn)表達(dá)增加，根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，在下一階段研究中，將通過改變骨髓瘤細(xì)胞系VDAC1的表達(dá)水平，進(jìn)一步探索VDAC1在疾病進(jìn)展及藥物治療中的作用，為VDAC1作為腫瘤治療新的靶點(diǎn)提供更明確的依據(jù)。

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Study on expression of VDAC1 gene in patients with multiple myeloma

LIANG Qing, LI Kaili, Liu Shangqin

(Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, Hubei, China)

Objective It is to investigate the expression of voltage-dependent anion channel 1(VDAC1) in patients with multiple myeloma so as to explore its relationship with tumor cell metabolism and apoptosis. Methods 20 patients with multiple myeloma were selected into observe group and 10 cases of non tumor patients were into control group. The expressions of VDAC1 gene in bone marrow mononuclear cells were detected by RT-PCR in both groups. Results The expression of VDAC1 gene in the observe group was higher than that in the control group (P<0.05). In observe group, the expression of VDAC1 gene of patients in stage Ⅲ was markedly higher than that of patients in stage Ⅰ and Ⅱ (P<0.05), and that in stage Ⅱ was markedly higher than that in stage Ⅰ (P<0.05). Conclusion The high expression of VDAC1 in patients with multiple myeloma may be related to the high metabolism of tumor cells, plays an important role in tumor cell apoptosis. VDAC1 will provide a new direction for the treatment of multiple myeloma.

voltage-dependent anion channel of mitochondrial outer membrane 1; multiple myeloma; gene expression

梁青，女，碩士研究生，研究方向?yàn)檠合到y(tǒng)惡性腫瘤。

國家自然科學(xué)基金資助項目(81272627)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.21.003

R551.3

A

1008-8849(2015)21-2287-03

2015-03-02