裴仉福等

摘要：通過剖檢病理變化、細(xì)菌分離鑒定、藥敏試驗(yàn)和RT-PCR等方法確診了一例高致病性豬繁殖與呼吸綜合征及副豬嗜血桿菌的混合感染，在此基礎(chǔ)上提出和實(shí)施了相應(yīng)的防治措施。

關(guān)鍵詞：高致病性豬繁殖與呼吸綜合征；副豬嗜血桿菌；診斷；防治

中圖分類號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2014）11-0005-04

廣東某豬場有基礎(chǔ)母豬約5 000頭，在2012年1月17日發(fā)現(xiàn)一單元母豬發(fā)熱嗜睡，皮膚發(fā)紅，且抗生素治療無效，發(fā)病率50%，病死率20%。然后陸續(xù)各階段的豬均有發(fā)病和死亡，持續(xù)近2個(gè)月，其中保育豬的發(fā)病率為60%，平均死淘率為48%，經(jīng)濟(jì)損失巨大。主要癥狀表現(xiàn)為眼結(jié)膜發(fā)炎、眼臉?biāo)[，皮膚發(fā)紅，精神沉郁、咳嗽、喘氣，耳、腹下呈紫色，皮下有點(diǎn)狀出血，腹式呼吸。體溫在41～42 ℃。部分豬便秘，糞便呈球粒狀；部分豬腹瀉；嘔吐黃色渾濁物；死亡豬鼻腔出血；部分哺乳仔豬；保育豬有神經(jīng)癥狀；懷孕母豬流產(chǎn)、死胎等。華南動(dòng)物疫病檢測中心對(duì)豬場送來的病豬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷并提出了防治措施。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 發(fā)病豬場送檢病豬2頭。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 藥敏試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂TSA、胰蛋白胨大豆肉湯TSB、胰蛋白胨、酵母提取粉均購自O(shè)xiod公司；NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）、新生小牛血清購自廣州威佳科技有限公司；Taq DNA聚合酶、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、PrimeScript OneStep RT-PCR Kit、pMD18-T simple vector、premix EX Taq、DL2000DNA Marker、DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自寶生物工程（大連）有限公司；Gel Extraction Kit購自O(shè)MEGA 公司等；細(xì)菌DNA 抽提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；副豬嗜血桿菌特異性引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Nsp2 1594～1680變異株）反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測試劑盒為北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 無菌條件下，用接種環(huán)取肺、肝、脾、腎、淋巴結(jié)，接種在TSA血平板、巧克力瓊脂（含NAD和酵母浸膏），37 ℃培養(yǎng)18～24 h，然后對(duì)疑似副豬嗜血桿菌（HPS）挑單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，對(duì)純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2 生化試驗(yàn) 將純化的細(xì)菌接種到TSB（含有V因子）培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)18 h后，吸取少量培養(yǎng)產(chǎn)物接種于生化管中，封蓋，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24～72 h后，觀察結(jié)果。

1.2.3 衛(wèi)星現(xiàn)象檢測 把副豬嗜血桿菌的可疑純化菌落水平劃線接種于普通血平板上，再挑取金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)基上垂直劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)菌生長情況。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 挑單菌落接種到TSB兔血NAD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，取100μL菌液涂于巧克力瓊脂平板，使用K-B法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)NCCLS（2006）的標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.2.5 細(xì)菌的PCR鑒定 采用16SrDNA通用引物（ 5′-AGATGATCMTGGCTCAG-3′）、1492R（5′-TACGGH TACCTTACGACTT-3′）擴(kuò)增16SrDNA，預(yù)期的片段大小為822 bp。

將分離的細(xì)菌抽提DNA，按照細(xì)菌DNA 抽提試劑盒說明書完成。抽提好細(xì)菌DNA后，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；56 ℃退火40 s；72 ℃延伸40 s；運(yùn)行30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR完成后，取5μL PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外投射儀中觀察結(jié)果。

1.2.6 病毒性疾病的RT-PCR 檢測及序列測定 按照豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Nsp2 1594～1680變異株）反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測試劑盒說明書，對(duì)病豬的肺組織進(jìn)行RT-PCR，將目的片段膠回收純化后，克隆入pMD-18T，送北京華大基因研究中心測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢病理變化

剖檢發(fā)現(xiàn)，病豬均出現(xiàn)不同程度的間質(zhì)性肺炎（圖1），肺部出現(xiàn)明顯肺炎病灶，小葉間隙加寬，氣管和支氣管有血性黏液滲出物。心包膜和胸腔大量積液（圖2），心臟有大量出血斑，有明顯的“絨毛心”現(xiàn)象。喉頭出血（圖3），淋巴結(jié)腫大，腎臟有少量出血點(diǎn)，胸腔及腹腔有纖維蛋白滲出。子宮黏膜表面粗糙鈣化易脫落。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

劃線接種、過夜培養(yǎng)后，在TSA平板上可觀察到菌落光滑、灰白色透明，直徑大約0.5 mm、針尖大小表面隆起的菌落（圖4）。經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，形態(tài)多樣，從單個(gè)球桿狀到長、細(xì)長以及絲狀菌體，為革蘭氏陰性小桿菌（圖5）。

2.3 生化試驗(yàn)

將分離純化后的細(xì)菌進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果表明，分離菌株發(fā)酵蔗糖、葡萄糖、麥芽糖，對(duì)甘露醇、硫化氫、吲哚、氧化酶、賴氨酸生化反應(yīng)均為陰性，觸酶試驗(yàn)為陽性，結(jié)果符合副豬嗜血桿菌的特性。

2.4 衛(wèi)星現(xiàn)象檢測

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)離金黃色葡萄球菌劃線生長區(qū)越近，其菌落越大、越多；反之，菌落越小，甚至無菌生長（圖6）。

2.5 藥敏試驗(yàn)

參照NCCLS（2006）標(biāo)準(zhǔn)以敏感（S）、中敏（I）、耐藥（R）3種形式對(duì)抑菌圈大小進(jìn)行判斷。結(jié)果（表1）表明，分離菌對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻吩、替卡西林棒酸、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、頭孢氨苯等高度敏感；對(duì)克林霉素、阿莫西林/棒酸2：1呈中度敏感；對(duì)氨芐西林、土霉素、阿莫西林、紅霉素、丁胺卡那雷素、林可雷素等耐藥。