何蕾 王寶輝 呂望 泮輝 胡堅

藤黃酸誘導肺癌細胞H1975凋亡的機制研究

何蕾 王寶輝 呂望 泮輝 胡堅

目的研究藤黃酸（GA）誘導人肺癌細胞H1975凋亡的分子機制，探討氧自由基（ROS）和JNK信號通路在GA殺傷肺癌細胞中的作用。方法以人肺癌細胞H1975為研究對象，MTT法測定GA抑制細胞增殖的作用，Annexin V/PI雙染法測定細胞凋亡率，DCFH-DA法測定ROS含量，JC-1探針染色分析線粒體膜電位（MMP），Western b lot檢測JNK信號通路的激活和線粒體凋亡途徑相關蛋白表達的變化。結果GA呈劑量依賴性抑制H1975細胞的增殖，各實驗組細胞存活率與空白對照組比較，均有統(tǒng)計學差異（P＜0．05或0．01）。1、2．5和5μmol/LGA作用24h后，細胞凋亡率分別為25．2%、51．8%和75．1%，剪切型凋亡相關蛋白c leaved caspase-9、c leaved caspase-3和c leaved PARP的表達隨GA濃度增高而顯著增加，與空白對照組比較，均有統(tǒng)計學差異（P＜0．05或0．01）。GA作用2h后H1975細胞ROS含量顯著升高，磷酸化JNK（p-JNK）表達上調（P＜0．05或0．01）。GA作用16h后各實驗組細胞MMP均明顯降低（均P＜0．05）。GA作用24h后實驗組細胞線粒體凋亡途徑相關蛋白Bax、Bak、Bik表達增加，而抗凋亡蛋白Bc l-2表達與空白對照組相比明顯下降（P＜0．05或0．01）。結論GA具有誘導H1975細胞凋亡的作用，其可能機制是上調細胞內ROS含量，激活JNK信號通路，進而引起MMP降低和線粒體凋亡途徑激活。

藤黃酸 肺癌H1975細胞 活性氧自由基 JNK信號通路 凋亡

目前，我國肺癌的發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤第1位[1]。近30年來肺癌的手術治療、放化療、新輔助治療等取得了重大進展，但總體治療效果仍不理想，ⅢA、ⅢB、Ⅳ期肺癌患者的5年生存率仍只有19.0%、7.0%和2.0%[2]。因此，尋找高效低毒的新型抗肺癌藥物對于提高中晚期患者的生存率具有重要意義。中藥藤黃取自藤黃科植物藤黃樹（Garcinia hanburyi Hook.F.）分泌的干燥樹脂，性寒，味酸、辛、澀，主治癰疽腫毒，頑癬惡瘡[3]。藤黃酸（GA）是中藥藤黃的主要活性成份，具有廣譜抗腫瘤活性，能夠有效抑制肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌等腫瘤細胞的增殖，且未對機體造血細胞的功能造成影響[4-6]，但GA抑制肺癌細胞增殖的分子機制尚未完全闡明。本研究以人肺癌細胞H1975為對象，觀察GA對腫瘤細胞增殖的抑制作用，并探討GA誘導細胞凋亡的分子機制。

1 材料和方法

1.1 藥物和細胞株 藤黃酸（C38H44O8，分子量628.76Da）購自成都曼思特生物科技有限公司，以二甲基亞砜（DMSO）配成50mmol/L的母液，-20℃保存，應用時以完全培養(yǎng)基稀釋至目標濃度。人肺癌細胞株H1975購自中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑及儀器 MTT、DCFH-DA購自美國Sigma公司，Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit和MitoScreen（JC-1）Kit購自美國BD公司。兔抗人p-JNK、JNK、Bax、Bak、Bik、Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP、β-actin多克隆抗體及HRP標記的羊抗兔IgG抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司。ECL化學發(fā)光試劑購自美國Thermo公司。iMark酶標儀、蛋白電泳及轉印裝置、凝膠成像系統(tǒng)均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將H1975細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 MTT法檢測GA對H1975細胞增殖的影響H1975細胞按5.0×103個/孔接種于96孔板，細胞貼壁后棄去上清液，各實驗組分別加入100μl含0.5、1、2.5和5μmol/L GA的完全培養(yǎng)基，每組設3個平行孔，空白對照組加入等體積的完全培養(yǎng)基。藥物作用24h后，以MTT法分析GA對H1975細胞增殖的影響，酶標儀測定各孔490nm處A值，細胞存活率（%）=實驗組平均A值/空白對照組平均A值×100%，實驗重復3次。

1.3.3 流式細胞術檢測GA對細胞凋亡率的影響 H1975細胞按3×105個/孔接種于6孔板。細胞貼壁后，實驗組分別加入GA濃度為1、2.5和5μmol/L的含藥培養(yǎng)基，空白對照組加入等體積的完全培養(yǎng)基，藥物作用24h后收集各組細胞。洗滌、重懸細胞后取100μl細胞懸液加入10μl Annexin V-FITC標記液和10μl PI，混勻，室溫避光孵育15min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.4 DCFH-DA法測定細胞內ROS含量 細胞培養(yǎng)同上述，待細胞貼壁后，PBS洗滌2次，每孔加入1ml RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA（終濃度為10μmol/L），避光孵育30min。PBS洗滌2次，分別加入GA濃度為1、2.5和5μmol/L的含藥培養(yǎng)基和等體積的完全培養(yǎng)基。藥物作用2h后收集各組細胞，流式細胞儀在激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm下檢測細胞平均熒光強度，分析細胞內ROS含量。

1.3.5 JC-1探針分析GA對細胞線粒體膜電位（MMP）的影響 細胞培養(yǎng)同上述，待細胞貼壁后，PBS洗滌2次，分別加入GA濃度為1、2.5和5μmol/L的含藥培養(yǎng)基和等體積的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)16h，收集各組細胞，加入JC-1探針室溫避光孵育15min，洗滌2次，以488nm為激發(fā)波長，流式細胞儀檢測MMP的改變。

1.3.6 Western blot檢測JNK通路活性和凋亡相關蛋白的表達 細胞培養(yǎng)及藥物處理同上述。抽提GA作用2h和24h的各組細胞總蛋白，其中GA作用2h收集的蛋白檢測p-JNK、JNK，作用24h收集的蛋白檢測Bax、Bak、Bik、Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP，以β-actin作為內參照。上樣檢測，化學發(fā)光試劑顯色，膠片貼近曝光，顯影、定影后用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組樣本均數(shù)比較用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗。

2 結果

2.1 GA抑制H1975細胞增殖 MTT法檢測結果表明GA具有抑制H1975細胞增殖的作用，并呈劑量依賴性。0.5、1、2.5和5μmol/L的GA作用后各實驗組細胞存活率分別為（91.8±5.1）%、（63.7±3.8）%、（31.5±4.8）%和（10.6±2.7）%，除0.5μmol/L組外，其余3組與空白對照組相比均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或0.01）。GA作用24h，對H1975細胞增殖抑制的IC50為1.6μmol/L。

2.2 GA誘導H1975細胞凋亡 Annexin V-FITC/PI雙染法結果提示，1、2.5和5μmol/L GA作用24h，H1975細胞早期凋亡率分別為25.2%、51.8%和75.1%，均高于空白對照組的早期凋亡率4.9%（均P＜0.05），見圖1。

圖1 GA對H1975細胞凋亡的影響（A：空白對照組；B：GA 1μmol/L；C：GA 2.5μmol/L；D：GA 5μmol/L）

進一步采用Western blot法檢測GA作用24h后H1975細胞內凋亡相關蛋白的表達，各實驗組細胞內剪切型凋亡相關蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP表達水平與空白對照組相比均顯著上調（P＜0.05或0.01），見圖2。

圖2 GA對H1975細胞內凋亡相關蛋白表達的影響

2.3 GA對H1975細胞內ROS含量的影響 與空白對照組相比，1、2.5和5μmol/L的GA作用2h后，細胞內ROS含量均明顯增加（均P＜0.05），且ROS含量隨GA濃度的增高而上升，表明GA以劑量依賴方式增加H1975細胞內ROS的含量，見圖3。

圖3 GA對H1975細胞內ROS含量的影響（A：空白對照組；B：GA 1μmol/L；C：GA 2.5μmol/L；D：GA 5μmol/L）

2.4 GA對H1975細胞內JNK信號通路相關蛋白表達的影響 Western blot結果提示，GA作用2h后H1975細胞內p-JNK的表達水平隨藥物濃度增高而顯著上升，與空白對照組比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或0.01），但不同濃度GA作用后各實驗組間的p-JNK表達水平無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見圖4。

圖4 GA對H1975細胞內JNK信號通路相關蛋白表達的影響

2.5 GA對H1975細胞MMP的影響 GA作用16h后，H1975細胞MMP較空白對照組明顯降低，均有統(tǒng)計學差異（均P＜0.05），且不同濃度GA作用后各實驗組細胞MMP降低趨勢呈劑量依賴關系，見圖5。

2.6 GA對H1975細胞線粒體凋亡途徑相關蛋白表達的影響 進一步檢測GA作用24h后線粒體凋亡途徑相關蛋白Bax、Bak、Bik和Bcl-2表達的變化，發(fā)現(xiàn)JNK下游促凋亡靶基因Bax、Bak、Bik的蛋白表達隨GA濃度增加而增高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達卻呈下降趨勢（P＜0.05或0.01），見圖6。

3 討論

GA是中藥藤黃的主要活性成份，作為一種多靶點抗腫瘤藥物，能通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡和分化、抗腫瘤細胞轉移等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[7-8]。張洪明等[9]報道GA對人肺癌細胞SPC-A-1的增殖具有顯著的抑制作用，其分子機制與上調促凋亡蛋白p53的表達，激活caspase-9、caspase-10，啟動凋亡級聯(lián)反應有關。但對與細胞增殖、凋亡密切相關的ROS-JNK信號通路在GA誘導肺癌細胞凋亡中的作用尚無研究報道，本研究以人肺癌細胞H1975為研究對象，通過體外抗腫瘤活性評價及相關機制研究，證實GA可通過上調細胞內ROS含量，激活JNK信號通路，進而引起MMP降低和線粒體凋亡途徑激活，最終誘導肺癌細胞凋亡。

圖5 GA對H1975細胞MMP的影響（A：空白對照組；B：GA 1μmol/L；C：GA 2.5μmol/L；D：GA 5μmol/L）

圖6 GA對H1975細胞線粒體凋亡途徑相關蛋白表達的影響

細胞內源性ROS含量增加被認為是激活JNK的重要誘因[10]。Wang等[11]報道GA具有上調卵巢癌細胞株SKOV3內源性ROS含量的作用，本研究也證實GA能夠上調肺癌細胞ROS含量。進一步檢測下游應激活化蛋白激酶JNK的磷酸化水平，證實GA具有激活JNK的作用。ROS可通過促進絲裂原活化蛋白激酶激酶（MAPKK）家族中的凋亡調節(jié)信號激酶1（ASK1）的磷酸化，進而激活JNK[12]；還可通過促進谷胱甘肽硫轉移酶（GST）寡聚化，導致GST/JNK復合體解離從而活化JNK[13]。GA上調內源性ROS含量通過何種途徑激活JNK信號通路，以及GA激活JNK是否僅依賴于ROS的上調有待進一步研究。

JNK信號通路的活化可導致細胞凋亡[14]，本研究亦發(fā)現(xiàn)H1975細胞凋亡率在GA干預后顯著上升?；罨腏NK可通過轉錄依賴的方式調節(jié)靶基因表達而誘導細胞凋亡[15]，本研究證實GA干預后JNK下游促凋亡靶基因Bax、含有BH3結構域家族的Bak、Bik蛋白表達上調，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降。正常細胞中，Bcl-2與Bax和線粒體膜本體蛋白Bak以異源二聚體形式存在，阻止Bax和Bak的寡聚化，從而維持MMP，抑制細胞色素C（Cyt C）的釋放。當Bax、Bak與Bcl-2比例失衡，將導致電壓依賴的陰離子通道（VDAC）開放和線粒體通透性轉化孔（PTP）形成，進而引起MMP的降低和促凋亡內容物，如Cyt C、細胞凋亡誘導因子（AIF）、細胞凋亡誘導因子核酸內切酶G（Endo G）等的外漏[16-17]，Bik亦參與PTP的形成和促凋亡內容物的釋放[17]。釋放的Cyt C與胞質的凋亡肽酶激活因子-1（Apaf-1）形成復合物，暴露caspases募集結構域（CARD），導致caspase-9發(fā)生二聚化，產(chǎn)生37kD的活性片段[18]。因此，本研究進一步檢測了GA對MMP和cleaved caspase-9表達的影響，結果提示GA作用后MMP明顯降低、cleaved caspase-9表達顯著增加，證實線粒體凋亡途徑參與了GA誘導的肺癌細胞凋亡。

線粒體凋亡途徑的活化啟動了caspase級聯(lián)反應，進而完成caspase-3對底物PARP的剪切滅活[19]。本研究證實GA作用后，H1975細胞表達17、19kD的caspase-3活化片段增加，且隨著GA濃度增高而進一步增加；同時其底物PARP被剪切成89kD的、不具有結合損傷DNA能力的片段，導致受PARP負調控的核酸內切酶活性增高，降解核小體DNA引起細胞凋亡[20]。

綜上所述，GA通過增加H1975細胞內源性ROS含量，激活JNK信號通路，導致促凋亡蛋白Bax、Bak、Bik與抗凋亡蛋白Bcl-2表達失衡，進而引起MMP降低和線粒體凋亡途徑激活，最終誘導肺癌細胞凋亡。

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ObjectiveTo investigate the effec t of gambogic acid(GA)on apop tosis of human lung cancer H1975 cells and its mechanism s．a(chǎn)nd JNK signaling pathway in killing lung cancer cells by GA．MethodsHuman lung cancer H1975 cells were treated w ith GA(1,2．5 and 5μmol/L)．Cellp roliferation was analyzed by MTT assay;cellapop tosis was detected by Annexin V-FITC/PI doub le staining．The Reactive oxygen species(ROS)was measured by DCFH-DA method;the changes ofm itochond rialmemb rane potential(MMP)were detec ted by JC-1 p robe method;the activation of JNK signaling pathway and the exp ression ofm itochond rial apop tosis-related p roteins were detected by Western b lot．ResultsCompared w ith control g roup,the p roliferation of H1975 cells was inhibited by GA in a dose-dependentmanner(P＜0．05 or 0．01):the apop totic rates were increased by 25．2%,51．8%and 75．1%,after cells were treated w ith 1,2．5 and 5μmol/L of GA for 24h．The exp ression of c leaved caspase-9,c leaved caspase-3 and c leaved PARP in GA group were significantly higher than those in controlgroup in a dose-dependentmanner(P＜0．05 or 0．01)．Com pared w ith controlg roup,the ROS levels were significantly increased and the exp ression of phospho-JNK(p-JNK)was up-regulated after treated w ith GA for 2h．After treated by GA for 16 h,the MMP in GA g roup was dec reased significantly com pared w ith the controlg roup(P＜0．05)．GA increased the exp ression of p ro-apop totic p rotein Bax,Bak,Bik and dec reased the exp ression of p ro-survival p rotein Bc l-2(P＜0．05 or 0．01)．ConclusionGambogic acid can induce the apop tosis of human lung cancer H1975 cells through up-regulating the intracellular levelof ROS to activate JNK signaling pathway,the latter triggers loss of MMP and activation ofm itochond ria apop tosis pathways．

Gambogic acid Lung cancer H1975 cell Reactive oxygen species JNK signaling pathway Apop tosis

2013-10-24）

（本文編輯：胥昀）

浙江中醫(yī)藥大學校級課題（2014ZY13）

310003 杭州，浙江大學附屬第一醫(yī)院心胸外科（何蕾、呂望、泮輝、胡堅，何蕾系浙江大學碩士研究生，現(xiàn)在浙江國際旅行衛(wèi)生保健中心工作）；浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院中心實驗室（王寶輝）

胡堅，E-mail：hujian_1@yahoo.com.cn