姚遠(yuǎn)，喬佳鑫，李靜，李慧，莫日根

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大腸桿菌TorS/TorR二組分體應(yīng)答蛋白TorR對(duì)DNA復(fù)制起始的影響

姚遠(yuǎn)，喬佳鑫，李靜，李慧，莫日根

內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021

二組分體作為一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)在細(xì)菌中普遍存在，能夠感知外界環(huán)境變化并做出應(yīng)答。細(xì)菌中CckA/CtrA、ArcA/ArcB和PhoP/PhoQ二組分體與DNA復(fù)制起始和細(xì)胞分裂相關(guān)，但目前還未見(jiàn)TorS/TorR二組分體對(duì)細(xì)胞周期及DNA復(fù)制影響的相關(guān)報(bào)道。大腸桿菌TorS/TorR二組分體能夠監(jiān)測(cè)細(xì)胞周圍氧化三甲胺(Trimethylamine oxide, TMAO)的濃度變化，但其是否影響DNA復(fù)制起始呢？文章利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了Δ和Δ突變體菌株的復(fù)制式樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Δ突變菌株每個(gè)細(xì)胞復(fù)制起始原點(diǎn)數(shù)目和倍增時(shí)間與野生型細(xì)胞一致，而Δ突變菌株每個(gè)細(xì)胞復(fù)制起始原點(diǎn)數(shù)目多于野生型細(xì)胞，說(shuō)明復(fù)制起始發(fā)生時(shí)間比野生型細(xì)胞早。但是過(guò)表達(dá)TorR蛋白或者共同表達(dá)TorS和TorR蛋白都不能使Δ突變體表型恢復(fù)為野生型表型。而在野生型和Δ突變細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SufD蛋白能使復(fù)制起始提早發(fā)生，在Δ和Δ雙突變細(xì)胞中復(fù)制起始延遲。所以，TorR可能通過(guò)改變基因的表達(dá)來(lái)間接影響染色體復(fù)制起始。

TorS/TorR二組分體；應(yīng)答蛋白TorR；DNA復(fù)制；大腸桿菌

細(xì)菌時(shí)時(shí)刻刻都被各種分子所包圍，這些分子或者來(lái)自于周圍環(huán)境，或者來(lái)自于細(xì)菌本身的代謝產(chǎn)物。所以，細(xì)菌要想保證自身存活和繁殖，就必須做出應(yīng)答來(lái)適應(yīng)周圍不斷變化的環(huán)境。而這些應(yīng)答途徑的激活大多都是先接受一個(gè)外界信號(hào)分子的刺激，然后激活特異性基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)菌中，由結(jié)合于細(xì)胞膜的組氨酸激酶(Histidine kinase)和其相互協(xié)作的應(yīng)答蛋白(Response regulator)組成的二組分體(Two-component system)可以感知溫度、滲透壓和pH值等環(huán)境變化，從而激活(或抑制)靶基因表達(dá)，使細(xì)胞做出相應(yīng)的應(yīng)答[1]。二組分體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)以下步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)：接受外界信號(hào)刺激的組氨酸激酶將ATP上磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到其特定的組氨酸殘基上，相繼磷酸基團(tuán)會(huì)被轉(zhuǎn)移到應(yīng)答蛋白的天冬氨酸殘基，磷酸化會(huì)引起應(yīng)答蛋白構(gòu)型的改變，從而影響其與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合的能力[2]，由此誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)環(huán)境變化做出反應(yīng)。

大腸桿菌TorS/TorR二組分體中TorS是一個(gè)跨膜的組氨酸蛋白激酶，TorS通過(guò)N-末端特異性感知細(xì)胞外環(huán)境中的氧化三甲胺(Trimethylamine oxide, TMAO)濃度，并使自身His443位點(diǎn)磷酸化，依次將磷酸基團(tuán)傳遞到自身Asp723和C-末端的His850位點(diǎn)，最終轉(zhuǎn)移到TorR接收區(qū)域的Asp53位點(diǎn)。磷酸化的TorR蛋白可以誘導(dǎo)操縱子的表達(dá)，從而應(yīng)答細(xì)胞周圍TMAO的濃度變化[3]。

研究表明，細(xì)菌中CckA/CtrA、ArcA/ArcB和PhoP/PhoQ二組分體與DNA復(fù)制起始和細(xì)胞分裂相關(guān)[4~6]。但目前還未見(jiàn)TorS/TorR二組分體對(duì)細(xì)胞周期及DNA復(fù)制影響的相關(guān)報(bào)道。本文發(fā)現(xiàn)，相對(duì)野生型細(xì)胞，Δ突變細(xì)胞的復(fù)制起始提早發(fā)生，但在Δ突變細(xì)胞中，過(guò)量表達(dá)TorR不能使Δ突變表型恢復(fù)。進(jìn)一步研究表明，TorR可能通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)量來(lái)間接影響DNA復(fù)制起始。

1 材料和方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

本研究使用的所有菌株均為K-12。野生型菌株BW25113和其派生的::R、::R、::R、::R、::R、::R、::R、::R、::R、::R缺失突變菌株由美國(guó)亞利桑那州立大學(xué)施一燊博士惠贈(zèng)。pACYC177[7]和pcDNA3-mCherry[8]質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存，p、p[9]和pUHE21- 2lac[10]質(zhì)粒由施一燊博士惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

將基因連同其自身的啟動(dòng)子利用一對(duì)特異性引物(正向：5￠-CCGCTCGAGTTGCTCGCTTCC-AGTTTG-3￠；反向：5￠-CGGGATCCTGTCAGCCC-ACC-GATTTT-3￠)，以BW25113基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)Ⅰ和HⅠ限制性內(nèi)切酶消化后連接到同樣用這兩種酶消化后的pACYC177片段上，獲得p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(圖1A)。為了構(gòu)建TorR-mCherry融合表達(dá)質(zhì)粒，先將基因連其自身啟動(dòng)子同時(shí)缺失終止密碼子的片段利用特異性引物(正向：5￠-CCCAAGCTTG-CGCCAGTACCGACCAACG-3￠；反向：5￠-CGGGGT-ACCGCACACATCAGCGGCTAAG-3￠)以BW25113菌株基因組DNA為模板經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，得到兩端分別帶有dⅢ和Ⅰ酶切位點(diǎn)的片段。然后，利用特異性引物(正向：5￠-CGGGGTACCGTGAGC-AAGGGCGAGGA-3￠；反向：5￠-CGGGATCCTTACT-TGTACAGCTCGTCCATGC-3￠)以pcDNA3-mCherry質(zhì)粒為模板經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，得到兩端分別帶有Ⅰ和HⅠ酶切位點(diǎn)的片段。將上述兩條片段經(jīng)過(guò)相應(yīng)限制性內(nèi)切酶的消化、連接，獲得-片段，之后將其插入到pACYC177質(zhì)粒的dⅢ和HⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)間，構(gòu)建了融合表達(dá)質(zhì)粒p-mCherry(圖1B)。根據(jù)基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)序列設(shè)計(jì)引物(正向：5￠-CG-GGATCCGTGAGTAAACGTTATTTTGTCACCGG-3￠；反向：5￠-CCCAAGCTTCTACAACAAGGCAAGGTT-TATGTAC-3￠)，以BW25113基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后用HⅠ和dⅢ限制性內(nèi)切酶消化，并連接到pUHE21-2lac質(zhì)粒啟動(dòng)子序列之后，獲得p質(zhì)粒，的表達(dá)需要IPTG誘導(dǎo)(圖1C)。p和p質(zhì)粒來(lái)源于ASKA庫(kù)，其或由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。

構(gòu)建好的質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用NCBI(www.ncbi.nim.nih.gov/)在線分析軟件進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)插入的基因未發(fā)生突變，質(zhì)粒構(gòu)建正確。

1.2.2 雙突變菌株的構(gòu)建

先將Δ突變菌株的卡那霉素抗性刪除[11]，之后利用P1轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)建得到ΔΔ雙突變菌株[12]，本文共得到23個(gè)雙突變菌株，隨機(jī)選取4個(gè)單菌落，利用PCR和流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，證明所得到的雙突變菌株構(gòu)建正確。

1.2.3 細(xì)胞倍增時(shí)間(Doubling time)的測(cè)定

將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按照1:10000倍數(shù)在ABTGcasa培養(yǎng)基[13]中稀釋，然后轉(zhuǎn)入37℃水浴搖床中培養(yǎng)。每隔15 min檢測(cè)活體細(xì)胞數(shù)目，用紫外分光光度計(jì)(Shimadzu, UV-1800)測(cè)量值(ABTGcasa培養(yǎng)基450)，記錄相應(yīng)的時(shí)間。如果質(zhì)粒需要IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在450≈0.03時(shí)加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG。450≈0.04開(kāi)始，450≈0.5結(jié)束。測(cè)得的值取底數(shù)為2的log值，與時(shí)間差(min)分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)，用Microsoft EXCEL作圖得到細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，線性方程的斜率即為細(xì)胞倍增時(shí)間。重復(fù)3次，得到的平均值為菌株在ABTGcasa培養(yǎng)基上的細(xì)胞倍增時(shí)間，比較野生型與突變體的細(xì)胞倍增時(shí)間。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定復(fù)制式樣和相對(duì)熒光強(qiáng)度

在ABTGcasa培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在450≈0.15時(shí)加入利福平(300 μg/mL)和先鋒霉素(10 μg/mL)，繼續(xù)讓細(xì)胞生長(zhǎng)3~4代。利福平能夠抑制新的復(fù)制起始，但允許已經(jīng)開(kāi)始的復(fù)制繼續(xù)進(jìn)行，先鋒霉素能夠阻止細(xì)胞分裂。收集細(xì)胞用70%乙醇固定，用Tris-HCl buffer(pH7.5)洗滌細(xì)胞，之后用Hoechst 33258 DNA染料染色30 min，用流式細(xì)胞儀(BD LSRFortessa)測(cè)定DNA復(fù)制式樣，具體方法和原理見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。檢測(cè)相對(duì)熒光強(qiáng)度的樣品與測(cè)定復(fù)制式樣的樣品相同，利用流式細(xì)胞儀PE-Texas Red通道檢測(cè)mCherry的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.2.5 熒光顯微鏡樣品的制備及觀察

熒光顯微鏡樣品與流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品的處理與制備方法相同，取10 μL固定樣品制片，利用熒光顯微鏡(蔡司Axio Imager A2)觀察，濾光片43(chroma filter sets 43，Carl Zeiss)觀察mCherry。同時(shí)用AxioCam MRc5相機(jī)拍照。最后使用AxioVision Rel. 4.8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖片處理。

圖1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

A：p質(zhì)粒構(gòu)建。圖中黑色長(zhǎng)方形代表基因的開(kāi)放閱讀框序列，灰色長(zhǎng)方形代表基因啟動(dòng)子。利用PCR擴(kuò)增出基因及其自身啟動(dòng)子的片段經(jīng)過(guò)Ⅰ和HⅠ消化連接到pACYC177質(zhì)粒上，經(jīng)過(guò)改造的質(zhì)粒具有氨芐青霉素抗性基因。B：p-mCherry質(zhì)粒構(gòu)建。圖中黑色長(zhǎng)方形代表基因的開(kāi)放閱讀框序列(ORF)，灰色長(zhǎng)方形代表基因啟動(dòng)子，白色長(zhǎng)方形代表基因，經(jīng)過(guò)改造的質(zhì)粒具有氨芐青霉素抗性基因。C：p質(zhì)粒構(gòu)建。圖中黑色長(zhǎng)方形代表基因的ORF區(qū)域，插入到pUHE21-2lac質(zhì)粒中HⅠ和dⅢ酶切位點(diǎn)之間，并位于啟動(dòng)子(p)之后，具有氨芐青霉素和氯霉素抗性基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 ΔtorR和ΔtorS突變菌株的鑒定

為了鑒定Δ和Δ突變菌株的正確性，本文分別以和基因的ORF序列為模板在基因內(nèi)部設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增大小合適的片段來(lái)檢測(cè)相應(yīng)基因是否被敲除。利用特異性引物(正向：5￠-GGATTGACCGTATTGTTGG-3￠；反向：5￠-GG-TGGCATTTGTGACGAA-3￠)，分別以BW25113和Δ菌株基因組DNA為模板，擴(kuò)增基因內(nèi)部262 bp片段(圖2A)。利用特異性引物(正向：5￠-TAA-TGAGCGGACGGGTGA-3￠；反向：5￠-TGGGTTAGC-GGGTTATCTT-3￠)，分別以BW25113和Δ菌株基因組DNA為模板，擴(kuò)增基因內(nèi)部490 bp片段(圖2B)。如圖2A所示，利用野生型BW25113基因組DNA(陽(yáng)性對(duì)照)為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，有明顯的目的條帶，以ddH2O(陰性對(duì)照)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，未見(jiàn)到目的條帶，利用Δ菌株基因組DNA為模板進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，也未檢測(cè)到目的條帶。圖2B以Δ菌株基因組DNA為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，并未檢測(cè)到目的條帶。以上結(jié)果證明，本文所獲得的缺失突變菌株構(gòu)建正確。

2.2 torR基因的缺失導(dǎo)致DNA復(fù)制起始的提早發(fā)生

為了檢測(cè)TorR對(duì)DNA復(fù)制起始的影響，將野生型、Δ和Δ細(xì)胞在ABTGcasa培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期，加入利福平(300 μg/mL)和先鋒霉素(10 μg/mL)培養(yǎng)細(xì)胞3~4代。經(jīng)Hoechst 33258 DNA染料染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)野生型、Δ和Δ突變細(xì)胞的復(fù)制式樣。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)野生型菌株主要有2、4、8條染色體的細(xì)胞，而在Δ突變體中只發(fā)現(xiàn)4、8條染色體的細(xì)胞，而且其細(xì)胞倍增時(shí)間(30 min)比野生型細(xì)胞(32 min)短，說(shuō)明TorR缺失導(dǎo)致復(fù)制起始的提早發(fā)生[14](圖3)。但是，Δ突變菌株和野生型細(xì)胞的復(fù)制式樣基本相同(圖3)，其細(xì)胞倍增時(shí)間和野生型細(xì)胞同為32 min，顯然，TorS的缺失并不改變DNA復(fù)制起始和細(xì)胞倍增時(shí)間。這些結(jié)果說(shuō)明，Δ突變菌株復(fù)制起始提早發(fā)生不是因?yàn)門(mén)orS/TorR二組分體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑阻斷所引起。

圖2 突變菌株的鑒定

A：Δ突變菌株的鑒定。泳道1、3~5：利用野生型BW25113基因組DNA(陽(yáng)性對(duì)照)為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增；泳道2：陰性對(duì)照；泳道6~8：利用Δ菌株基因組DNA為模板進(jìn)行目的片段擴(kuò)增。B：Δ突變菌株的鑒定。泳道1：陰性對(duì)照；泳道2：陽(yáng)性對(duì)照，以野生型BW25113基因組DNA為模板進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增；泳道3：以Δ菌株基因組DNA為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。

2.3 質(zhì)粒表達(dá)的TorR蛋白不能將ΔtorR突變表型恢復(fù)為野生型表型

將pACYC177和p過(guò)表達(dá)質(zhì)粒利用CaCl2法分別轉(zhuǎn)化到Δ突變體和野生型細(xì)胞中，按圖3中所述方法，用流式細(xì)胞儀測(cè)定兩者的染色體復(fù)制式樣(圖4)。結(jié)果表明，pACYC177不會(huì)影響野生型和Δ突變菌株的復(fù)制式樣(圖4：A，B)，在野生型和Δ突變菌株中過(guò)量表達(dá)TorR也不能改變其DNA復(fù)制式樣(圖4：C，D)。

2.4 TorR-mCherry融合蛋白的表達(dá)也不能恢復(fù)ΔtorR突變表型

基于用p質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不能使Δ突變細(xì)胞改變其復(fù)制起始提早發(fā)生的表型，本文推測(cè)p質(zhì)粒可能不表達(dá)TorR蛋白。因此，本文構(gòu)建了能夠表達(dá)TorR-mCherry融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒p-mCherry，-基因的表達(dá)受啟動(dòng)子的控制。為了驗(yàn)證p質(zhì)粒表達(dá)TorR蛋白，而p-mCherry表達(dá)TorR-mCherry融合蛋白，首先將p-mCherry質(zhì)粒利用CaCl2轉(zhuǎn)化法引入Δ突變菌株中，隨后用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測(cè)mCherry的表達(dá)情況(圖5A)、表達(dá)量(圖5C)及Δ/p-mCherry菌株的復(fù)制式樣(圖5B)。如圖5A所示，細(xì)胞有明顯的紅色熒光，說(shuō)明TorR-mCherry蛋白在細(xì)胞中有表達(dá)；流式細(xì)胞儀PE-Texas Red熒光通道也檢測(cè)到了mCherry發(fā)出的特異性熒光信號(hào)(圖5C)，而在對(duì)照質(zhì)粒p中未檢測(cè)到任何信號(hào)。這些結(jié)果說(shuō)明p和p-mCherry質(zhì)粒分別表達(dá)有TorR蛋白和TorR- mCherry融合蛋白。然而，由p-mCherry質(zhì)粒表達(dá)的TorR-mCherry融合蛋白依然不能使Δ突變的提早復(fù)制起始表型恢復(fù)為野生型表型(圖5B)。

圖3 ΔtorR缺失突變引起DNA復(fù)制起始提早發(fā)生

處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(ABTGcasa培養(yǎng)基)中加入利福平和先鋒霉素繼續(xù)培養(yǎng)3~4代后用70%酒精固定細(xì)胞。Hoechst 33258進(jìn)行染色后，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞所含的染色體數(shù)目進(jìn)行測(cè)定。橫坐標(biāo)表示每個(gè)細(xì)胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)測(cè)定包含了10 000個(gè)細(xì)胞。

圖4 過(guò)量表達(dá)TorR蛋白不能恢復(fù)ΔtorR突變表型

樣品處理和測(cè)定方法如圖3所述，橫坐標(biāo)表示每個(gè)細(xì)胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)目。A，B：野生型菌株或者Δ突變菌株中轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒pACYC177并不會(huì)影響復(fù)制式樣。C，D：野生型菌株或者Δ突變菌株中轉(zhuǎn)入p質(zhì)粒，過(guò)表達(dá)TorR不能影響其復(fù)制式樣。每個(gè)測(cè)定包含了10 000個(gè)細(xì)胞。

2.5 共表達(dá)TorR和TorS蛋白也不能使ΔtorR突變表型恢復(fù)為野生型表型

為什么過(guò)表達(dá)TorR不能恢復(fù)Δ突變表型？是否由于細(xì)胞內(nèi)TorS含量不足而不能有效磷酸化TorR，進(jìn)而導(dǎo)致該二組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻？為了探討以上問(wèn)題，本文將質(zhì)粒p和p共轉(zhuǎn)化到Δ突變菌株中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其DNA復(fù)制式樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同時(shí)過(guò)表達(dá)TorR和TorS蛋白不能使其DNA復(fù)制樣式改變，即與Δ突變細(xì)胞一樣，共表達(dá)TorR和TorS蛋白的Δ菌株仍然以含4、8條染色體的細(xì)胞為主(圖6)，其原因仍不清楚。

圖5 質(zhì)粒表達(dá)的TorR-mCherry融合蛋白不能恢復(fù)ΔtorR突變表型

A：熒光顯微鏡下觀察TorR-mCherry融合蛋白的亞細(xì)胞定位。圖中標(biāo)尺為1 μm，紅色表示TorR-mCherry。B：Δ突變菌株過(guò)量表達(dá)TorR-mCherry蛋白的DNA復(fù)制式樣，樣品處理方法如圖3所述。橫坐標(biāo)表示每個(gè)細(xì)胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)測(cè)定包含10 000個(gè)細(xì)胞。C：利用流式細(xì)胞儀測(cè)定Δ/p-mCherry菌株中TorR-mCherry的相對(duì)熒光強(qiáng)度值。橫坐標(biāo)表示mCherry相對(duì)熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)表示所測(cè)定的細(xì)胞數(shù)目。

圖6 共同表達(dá)TorR和TorS蛋白不能恢復(fù)ΔtorR突變的表型

樣品處理和測(cè)定方法如圖3中描述，橫坐標(biāo)表示每個(gè)細(xì)胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)目。：野生型細(xì)胞復(fù)制式樣；Δ：Δ突變細(xì)胞的復(fù)制式樣；Δ/p/p：Δ突變細(xì)胞共表達(dá)TorR和TorS蛋白后的DNA復(fù)制式樣。p質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L，每個(gè)測(cè)定包含10 000個(gè)細(xì)胞。

2.6 sufD和bioD基因缺失導(dǎo)致DNA復(fù)制起始滯后

研究表明，基因的缺失影響多個(gè)基因的表達(dá)，包括、、、、、、和等[15]。所以，TorR蛋白可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)來(lái)間接影響DNA復(fù)制起始。為了驗(yàn)證這個(gè)推測(cè)，本文利用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)了Δ、Δ、Δ、Δ、Δ、Δ、Δ和Δ突變細(xì)胞的DNA復(fù)制式樣。如圖7所示，除了Δ和Δ缺失突變體的復(fù)制式樣不同于野生型細(xì)胞外，其余突變菌株的復(fù)制式樣與野生型并無(wú)明顯差異。Δ和Δ缺失突變體與野生型相比，缺少含8條染色體的細(xì)胞，這說(shuō)明和基因的缺失會(huì)引起DNA復(fù)制起始延遲。

2.7 SufD蛋白過(guò)量表達(dá)引起DNA復(fù)制起始提早發(fā)生

在Δ缺失突變菌株中，基因的表達(dá)量高于野生型細(xì)胞[15]，此時(shí)DNA復(fù)制起始早于野生型細(xì)胞。因此，基因表達(dá)量的高低可能與DNA復(fù)制起始時(shí)間有直接聯(lián)系。本文分別在野生型菌株和Δ缺失突變菌株中過(guò)量表達(dá)SufD蛋白，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其復(fù)制式樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于野生型細(xì)胞，/p和Δ/p菌株DNA復(fù)制起始發(fā)生的時(shí)間都有明顯提前(圖8)。與/p細(xì)胞比較，Δ/p菌株有更多的細(xì)胞有8條染色體，說(shuō)明缺失TorR和過(guò)表達(dá)SufD的效果是累加的。而過(guò)表達(dá)BioD并不明顯改變?chǔ)と笔蛔凅w細(xì)胞的DNA復(fù)制式樣(圖9)。

圖7 sufD基因缺失導(dǎo)致DNA復(fù)制起始延遲

樣品處理和測(cè)定方法如圖3中描述，野生型菌株和突變體菌株在圖中已經(jīng)標(biāo)出，橫坐標(biāo)表示每個(gè)細(xì)胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)測(cè)定包含了10 000個(gè)細(xì)胞。

2.8 ΔtorRΔsufD雙突變會(huì)引起DNA復(fù)制起始延遲

利用P1轉(zhuǎn)導(dǎo)法[12]，構(gòu)建了ΔΔ雙突變體，并按圖3中所述方法檢測(cè)復(fù)制式樣，發(fā)現(xiàn)ΔΔ雙突變體中只存在含有2、4條染色體的細(xì)胞(圖10)，與野生型細(xì)胞相比其DNA復(fù)制起始延遲，與Δ單突變細(xì)胞的復(fù)制式樣一致，說(shuō)明對(duì)DNA復(fù)制起始而言，SufD蛋白的作用獨(dú)立于TorR蛋白。以上結(jié)果支持TorR蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)間接影響DNA復(fù)制起始。

3 討 論

本研究表明，Δ突變細(xì)胞的復(fù)制起始相較野生型細(xì)胞會(huì)提早發(fā)生，而Δ突變細(xì)胞的復(fù)制式樣與野生型相同。并且在Δ突變細(xì)胞中，不論過(guò)量表達(dá)TorR，還是共同表達(dá)TorR和TorS蛋白，都不能使Δ突變表型恢復(fù)。前人研究表明，基因能夠進(jìn)行自我調(diào)控，即當(dāng)細(xì)胞中TorR過(guò)量時(shí)，不論TorR是否被磷酸化，都會(huì)結(jié)合到基因啟動(dòng)子的上，阻斷的轉(zhuǎn)錄[16]，這或許可以解釋過(guò)量表達(dá)TorR并不能在互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中看到表型恢復(fù)的結(jié)果。SufD蛋白與SufB和SufC蛋白共同形成復(fù)合體，參與鐵硫簇的組裝[17]。當(dāng)細(xì)胞中缺乏SufD蛋白時(shí)，會(huì)引起復(fù)制起始延遲，而SufD過(guò)表達(dá)則使細(xì)胞復(fù)制起始提早發(fā)生，有研究表明基因缺失會(huì)導(dǎo)致基因的表達(dá)提高[15]。因此，TorR可能通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)量來(lái)影響鐵硫簇的組裝從而間接調(diào)控DNA復(fù)制起始。而SufD蛋白或者鐵硫簇如何調(diào)控DNA復(fù)制還需要進(jìn)一步探究。本文還發(fā)現(xiàn)Δ缺失突變導(dǎo)致DNA復(fù)制起始延遲。而在細(xì)胞中基因表達(dá)量低于野生型細(xì)胞[15]，但其DNA復(fù)制起始提早發(fā)生，也就是說(shuō)，基因的低表達(dá)并未導(dǎo)致復(fù)制起始提早發(fā)生。另外，在Δ缺失突變細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BioD也未見(jiàn)復(fù)制式樣的改變，這些結(jié)果建議TorR并不通過(guò)基因表達(dá)來(lái)影響DNA復(fù)制起始。

圖8 過(guò)量表達(dá)SufD蛋白引起DNA復(fù)制起始提早發(fā)生

樣品處理和測(cè)定方法如圖3中描述，野生型菌株，突變體菌株和質(zhì)粒在圖中已經(jīng)標(biāo)出，p質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L，橫坐標(biāo)表示每個(gè)細(xì)胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)測(cè)定包含了10 000個(gè)細(xì)胞。

圖9 過(guò)量表達(dá)BioD蛋白不能恢復(fù)ΔtorR突變表型

樣品處理和測(cè)定方法如圖3中描述，p質(zhì)粒IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L，橫坐標(biāo)表示每個(gè)細(xì)胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)測(cè)定包含了10 000個(gè)細(xì)胞。

圖10 ΔtorRΔsufD雙突變會(huì)引起DNA復(fù)制起始延遲

樣品處理和測(cè)定方法如圖3中描述，橫坐標(biāo)表示每個(gè)細(xì)胞所含染色體數(shù)目，縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)測(cè)定包含了10 000個(gè)細(xì)胞。

[1] Stock AM, Robinson VL, Goudreau PN. Two-component signal transduction., 2000, 69: 183–215.

[2] Buckler DR, Anand GS, Stock AM. Response-regulator phosphorylation and activation: a two-way street?, 2000, 8(4): 153–155.

[3] Jourlin C, Ansaldi M, Méjean V. Transphosphorylation of the torR response regulator requires the three phosphorylation sites of the torS unorthodox sensor in., 1997, 267(4): 770–777.

[4] Jacobs C, Ausmees N, Cordwell SJ, Shapiro L, Laub MT. Functions of the CckA histidine kinase incell cycle control., 2003, 47(5): 1279–1290.

[5] Soncini FC, Groisman EA. Two-component regulatory systems can interact to process multiple environmental signals., 1996, 178(23): 6796–6801.

[6] Colloms SD, Alén C, Sherratt DJ. The ArcA/ArcB two-component regulatory system ofis essential for Xer site-specific recombination at psi., 1998, 28(3): 521–530.

[7] Morigen, Boye E, Skarstad K, L?bner-Olesen A. Regulation of chromosomal replication by DnaA protein availability in: effects of theregion., 2001, 1521(1-3): 73–80.

[8] Zhang XM, Kong W, Ashraf S, Curtiss R Ⅲ. A one-plasmid system to generate influenza virus in cultured chicken cells for potential use in influenza vaccine., 2009, 83(18): 9296–9303.

[9] Kitagawa M, Ara T, Arifuzzaman M, Ioka-Nakamichi T, Inamoto E, Toyonaga H, Mori H. Complete set of ORF clones ofASKA library (a complete set ofK-12 ORF archive): unique resources for biological research., 2006, 12(5): 291–299.

[10] Soncini FC, Véscovi EG, Groisman EA. Transcriptional autoregulation of theoperon., 1995, 177(15): 4364–4371.

[11] Datsenko KA, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes inK-12 using PCR products., 2000, 97(12): 6640–6645.

[12] Miller RV, Ripp S, Replicon J, Ogunseitan O, Kokjohn TA. Virus-mediated gene transfer in freshwater environments. In: Gauthier MJ, ed. Gene Transfers and Environment. New York: Springer, 1992: 51–62.

[13] Morigen, Molina F, Skarstad K. Deletion of thesite does not affect once-per-cell-cycle timing but induces rifampin-resistant replication., 2005, 187(12): 3913–3920.

[14] Morigen, L?bner-Olesen A, Skarstad K. Titration of theDnaA protein to excesssites causes destabilization of replication forks, delayed replication initiation and delayed cell division., 2003, 50(1): 349–362.

[15] Oshima T, Aiba H, Masuda Y, Kanaya S, Sugiura M, Wanner BL, Mori H, Mizuno T. Transcriptome analysis of all two-component regulatory system mutants ofK-12., 2002, 46(1): 281–291.

[16] Ansaldi M, Simon G, Lepelletier M, Méjean V. The TorR High-Affinity Binding Site Plays a Key Role in BothAutoregulation andoperon Expression in., 2000, 182(4): 961–966.

[17] Selbach BP, Pradhan PK, Dos Santos PC. Protected sulfur transfer reactions by theSuf system., 2013, 52(23): 4089–4096.

(責(zé)任編委: 何群)

The effects of TorR protein on initiation of DNA replication in

Yuan Yao, Jiaxin Qiao, Jing Li, Hui Li, Morigen

The two-component systems, which could sense and respond to environmental changes, widely exist in bacteria as a signal transduction pathway. The bacterial CckA/CtrA, ArcA/ArcB and PhoP/PhoQ two-component systems are associated with initiation of DNA replication and cell division, however, the effects of the TorS/TorR system on cell cycle and DNA replication remains unknown. The TorS/TorR system incan sense changes in trimethylamine oxide (TMAO) concentration around the cells. However, it is unknown if it also affects initiation of DNA replication. We detected DNA replication patterns in Δand Δmutant strains by flow cytometry. We found that the average number of replication origins (s) per cell and doubling time in Δmutants were the same while the average number ofs in Δmutantswas increased compared with that in wild-type cells. These results indicated that absence of TorR led to an earlier initiation of DNA replication than that in wild-type cells. Strangely, neither overexpression of TorR nor co-expression of TorR and TorS could restore Δmutant phenotype to the wild type. However, overexpression of SufD in both wild type and Δmutants promoted initiation of DNA replication, while mutation of SufD delayed it in Δmutants. Thus, TorR may affect initiation of DNA replication indirectly through regulating gene expression of.

TorS/TorR two-component system; the response regulator TorR; DNA replication;

2014-09-01;

2014-09-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31360208)，內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金重大開(kāi)放項(xiàng)目(編號(hào)：20102009)和內(nèi)蒙古大學(xué)人才引進(jìn)科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：SPH-IMU, Z20090107)資助

姚遠(yuǎn)，在讀博士研究生，專業(yè)方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail:zhjyq129@163.com

莫日根，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，DNA復(fù)制與細(xì)胞周期。E-mail: morigenm@life.imu.edu.cn

10.16288/j.yczz.14-291

2015-1-5 10:50:43

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150105.1050.001.html