劉欣，張潔，趙春暉，李鐵松，王繼紅，李慶偉

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日本七鰓鰻物種特異性microRNAs及其前體的識別與驗證

劉欣1,2，張潔1,2，趙春暉1,2，李鐵松1,2，王繼紅1,2，李慶偉1,2

1. 遼寧師范大學生命科學學院，大連 116081；2. 遼寧師范大學七鰓鰻研究中心，大連 116081

MicroRNAs(miRNAs)對參與多種生物代謝過程的基因在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平進行負調(diào)控。近年來，隨著深度測序及芯片技術(shù)的應用，有關(guān)miRNA的發(fā)現(xiàn)和功能分析在植物和動物中得到廣泛研究。文章利用第二代測序技術(shù)對日本七鰓鰻()白細胞的小RNA進行了高通量測序，共得到5 207 787條小RNA序列，其中4 739 346條序列可以拼接為10 989種miRNA變體。基于序列相似性分析，發(fā)現(xiàn)這10 989個變體序列與306個已知的保守miRNA家族成員序列相匹配；其中，6個保守miRNA家族成員呈極高豐度表達，表明miRNA在物種間具有保守性。70個未注釋序列被預測為新的miRNA。通過miRNA微陣列技術(shù)鑒定與驗證了34個新預測的miRNA在免疫處理的日本七鰓鰻白細胞中表達，其中16個miRNA前體的最低折疊自由能系數(shù)大于0.85，說明日本七鰓鰻存在特異性miRNA。這些物種特異性miRNAs的存在可能在日本七鰓鰻的白細胞生長、發(fā)育和對疾病的反應中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

日本七鰓鰻；物種特異性miRNA；高通量測序；基因芯片

20世紀90年代，Lee等[1]首次在線蟲()中發(fā)現(xiàn)一種內(nèi)源的、長約22nt的非編碼小RNA，命名為lin-4；lin-4通過RNA-RNA的相互作用方式參與對線蟲胚胎后期發(fā)育基因lin-14的調(diào)控。2000年，Reinhart等[2]在中又發(fā)現(xiàn)了第二個長約21nt的非編碼小RNA——let-7，作為時序調(diào)控基因lin-14、lin-28、lin-41、lin-42和daf12的開關(guān)基因，let-7失活或過表達可導致線蟲幼蟲的滯育或早熟。

2001年，Lagos-Quintana等[3]從果蠅()和人體中克隆了49個類似線蟲lin-4的小RNA基因，并把它們正式定名為microRNA (miRNA)；研究發(fā)現(xiàn)，無脊椎動物和脊椎動物存在的這些新的miRNA在序列上高度保守。至2001年底，多個研究小組通過直接對小RNA克隆和測序從各種動物中鑒別出數(shù)百個miRNA基因[4,5]。之后，隨著多種模式生物基因組測序工作的相繼完成使得全基因組搜索miRNA成為可能[6]。結(jié)合分子克隆和計算機識別方法，在動物[7~9]、植物[10~14]甚至病毒中[15,16]確定了成千上萬的miRNA基因，僅在人類就驗證了2558個miRNAs (http://www.mirbase.org/cgi-bin/bro-wse.pl?org=hsa)[17]。對部分miRNAs的功能研究分析提示：miRNAs參與生命過程中一系列的重要進程，包括發(fā)育進程[2]、細胞增殖與凋亡[18]、脂肪代謝[19]、造血過程[20]、生殖干細胞自我更新[21]及腫瘤發(fā)生[22]等。

隨著第二代高通量測序技術(shù)的發(fā)展，已在越來越多的物種中發(fā)現(xiàn)了新的miRNA基因[23~26]。七鰓鰻屬于圓口綱、七鰓鰻目，是迄今為止最原始的無頜類脊椎動物，是現(xiàn)存脊椎動物亞門中最古老的物種[27]。長久以來，七鰓鰻在進化上因聯(lián)系著脊椎動物與無脊椎動物而具有極高的研究價值。目前，國內(nèi)外對七鰓鰻miRNA的研究很少，僅見Heimberga等[28]于2010年采用小RNA測序和基因組檢索方法對海七鰓鰻()、普氏七鰓鰻()和盲鰻()的miRNA進行了識別和鑒定，并以七鰓鰻和盲鰻的miRNAs作為保守的遺傳標記對它們之間的系統(tǒng)演化地位進行了討論。由于miRNA具有種間保守性、組織表達特異性和時序性，本文運用高通量測序以及基因芯片技術(shù)在日本七鰓鰻()免疫激發(fā)后的白細胞中發(fā)現(xiàn)和鑒定免疫組織中表達保守的miRNA以及物種特異性miRNA，以期對未來探索miRNA在其免疫應答過程中的調(diào)控作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

日本七鰓鰻捕獲自黑龍江省松花江流域同江地區(qū)，活體置于實驗室水族箱馴養(yǎng)(2~5℃)。1周后選取32條無外傷、健康的個體(體長35~55 cm) ，以腹腔注射100 μL復合抗原進行免疫刺激。復合抗原用50 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0) 配制，含大腸桿菌(DH5ɑ) (TaKaRa, Dalian)、滅活的金黃色葡萄球菌() (TaKaRa, Dalian) 和啤酒酵母菌() (市售)各1×107個/mL。經(jīng)過3次加強免疫(每周1次) ，末次免疫后3 d斷尾取血，采用ficoll密度梯度離心法進行單核白細胞分離[29]。

1.2 日本七鰓鰻小RNA測序及分析

使用RNAiso Reagent (TaKaRa, Dalian)提取日本七鰓鰻白細胞總RNA，在獲得符合測序標準的總RNA樣本后，委托深圳華大基因股份有限公司構(gòu)建測序文庫并用Illumina GA IIx進行測序及分析。經(jīng)Solexa測序，獲得35nt序列，通過去接頭、去低質(zhì)量、去污染、統(tǒng)計序列長度分布等過程完成初級分析。將初級分析得到的序列按照文獻[30]中的生物信息分析流程及分析軟件(包括BLAST和華大基因自主開發(fā)的分析軟件Tag2annotation)進行分類注釋，獲得樣品中包含的各種RNA及表達量信息。將其中miRNA片段與miRBase17.0中所有動、植物的miRNA成熟序列進行比對進行注釋，統(tǒng)計在樣品中出現(xiàn)的miRNA家族(不分物種)、序列及其數(shù)量。余下的未注釋片段以近緣種海七鰓鰻(.)基因組(http://asia.ensembl.org/Petromyzon_marinus/Info/ Index)為參考基因組進行新miRNA及其前體的預測。預測軟件采用華大基因自主開發(fā)的分析軟件MIREAP (http://sourceforge.net/projects/mireap/)[30]。利用mFOLD軟件(http://mfold.rit.albany.edu/?q= mfold/ Structure-display-and-free-energy-determination)計算獲得莖環(huán)結(jié)構(gòu)的最小折疊自由能(MFE，ΔG值(kcal/ mol))。以最小自由能量指數(shù)(MFEI，MFEI =(MFE/前體序列長度)×100/(G%+C%))大于0.85為鑒定miRNA前體的標準[31]。

1.3 miRNA基因芯片實驗與分析

miRNA的定制基因芯片檢驗工作委托美國LC Sciences公司進行實驗與分析。在μParaflo[32]微流體芯片上，每條檢測探針使用PGR(photogenerated reagent)化學法進行原位合成。被檢測目標選自miRBase中幾種低等脊椎動物的miRNA(如海七鰓鰻301條；佛羅里達文昌魚()189條；斑馬魚()248條；鉛點東方鲀()109條；玻璃海鞘()511條；非洲爪蟾()168條；囊舌蟲()114條)以及在日本七鰓鰻中預測的新miRNA 70條。雜交后檢測使用標記特異性的Cy5熒光染料。利用激光掃描儀(GenePix 4000B，Molecular Device)采集雜交圖像并使用Array-Pro圖像分析軟件(Media Cybernetics)進行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換。數(shù)據(jù)分析首先是減除背景值，然后使用LOWESS過濾(Locally-Weighted Regression)進行信號歸一化[33]。被列為可檢測的轉(zhuǎn)錄子必須至少符合兩個條件：信號強度>3×(背景標準偏差)并且點變異系數(shù)(spot)<0.5。值通過計算(標準偏差)/(信號強度)獲得。只有當超過50%的重復探針的信號值大于檢測水平，才認為該轉(zhuǎn)錄子可以被檢測[33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小RNA測序結(jié)果

通過高通量測序，最終獲得日本七鰓鰻各種小RNA分子數(shù)量見表1。共獲得5 207 787個小RNA讀數(shù)(Read)，其中miRNA有4 739 346個讀數(shù)，占91%，拼接后可歸為10 989種一致序列片段。有7.54%的小RNA片段屬于未注釋的未知序列，還有少量的轉(zhuǎn)運RNA(tRNA，0.74%)、核糖體RNA(rRNA，0.66%)、小核RNA(snRNA，0.05%)和核仁小RNA (snoRNA，0.01%)等，說明測序結(jié)果較好。日本七鰓鰻miRNA成熟序列的長度和其他物種一樣，大部分(占總數(shù)的87.66%)集中在20~24nt之間(圖1)。

2.2 保守miRNA家族表達譜

通過與數(shù)據(jù)庫比對，上述10 989條miRNA一致序列被注釋為306個保守miRNA家族的不同變體。其中201個保守miRNA家族的各個變體表達豐度之和小于10個讀數(shù)，說明大多數(shù)(65.7%)保守miRNA為低豐度表達；75個保守miRNA家族的各個變體表達豐度之和介于10~1 000之間，屬于中豐度表達；30個miRNA家族的表達豐度高于1 000個讀數(shù)(表2)，從編號可以看出它們絕大多數(shù)為最先被發(fā)現(xiàn)的miRNA家族(15個編號小于100，9個編號小于200)。這30個家族共包括9 560個miRNA變體，由4 729 961個讀數(shù)組成，分別占保守miRNA家族(共10 989條miRNA)一致序列的87.0%和總讀數(shù)(4 739 346)的99.8%。其中，let-7、miR-146、miR-184、miR-143、miR-30、miR-142等6個家族的miRNA表達豐度均超過10萬個讀數(shù)，占總讀數(shù)的94.1%。這些結(jié)果表明，極少數(shù)保守miRNA家族的成員呈極高豐度表達，反映出miRNA在物種間具有保守性。

表1 高通量測序獲得七鰓鰻小片段RNA種類及數(shù)量

圖1 七鰓鰻miRNA成熟序列核苷酸分布情況

表2 日本七鰓鰻高豐度表達的miRNA家族

2.3 七鰓鰻新miRNA的預測及驗證

利用高通量測序未注釋的小RNA片段，用華大基因自主構(gòu)建的miRNA及其前體預測軟件MIREAP共預測得到70個新的miRNA成熟序列。通過定制芯片微陣列分析驗證(表3)，有35個預測的新miRNA成熟序列的檢測信號符合信號強度大于基值的3倍且點變異系數(shù)(spot CV)小于0.5這兩個檢測條件，說明它們是真實存在的。

從表3中可見，有8種預測的物種特異性miRNA (Ljm-058、Ljm-037、Ljm-016、Ljm-073、Ljm-004、Ljm-049、Ljm-023和Ljm-065)的信號強度高于1 000，占23.5%；尤其是Ljm-058、Ljm-037和Ljm-073不僅芯片檢測信號強度高，而且在測序檢測中讀數(shù)值也高。信號強度介于100~1 000之間的有16個物種特異性miRNA，占47.1%。信號強度小于100的有10個，占29.4%。由此可見，大多數(shù)預測的物種特異性miRNA在受抗原免疫激發(fā)后的日本七鰓鰻免疫細胞中均有較高水平的表達。

對新預測的物種特異性miRNAs，其鑒定還需要預測是否存在能折疊成較穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體序列的支持。根據(jù)海七鰓鰻基因組數(shù)據(jù)，預測的物種特異性的miRNA的成熟和前體序列以及前體序列的二級結(jié)構(gòu)(GenBank序列登錄號：KJ031059~ KJ031093)見表4。這些miRNA前體的最小折疊自由能介于-19.7 kcal/mol~-49.56 kcal/mol之間，最小折疊自由能系數(shù)介于0.48~1.64之間。有16個miRNA前體的最小折疊自由能系數(shù)大于0.85。

表3 日本七鰓鰻新miRNA候選序列的定制miRNA芯片分析驗證

注：加粗的探針表示該探針所檢測的信號強度滿足文中設定的兩個檢測條件。

表4 日本七鰓鰻新miRNA序列及其二級結(jié)構(gòu)

續(xù)表

新預測miRNAmiRNA成熟及前體序列二級結(jié)構(gòu)預測Mfe(kcal/mol)MfeI Ljm-028-3pGATGGTGATAGGTGCAGTGCTGCAAGTTACTCTTTTGATGAAATTACATAGTGATTTGTGATTGCGGGCTACTGAGGCAGATTCCAT.((((.(((..((.(((((((((((.((((...((..(((......)))...))...)))))))).))).))))..))..)))))))-30.20.81 Ljm-030-3pTCCAGTGCTGGAAGCTTCTGCAGGGAACGGACTTCACTCAGCTGAGTTGACGCGACTGAATTGATTCAACTCCTTGAAGAAGCTCCCAGCAGGTGG.(((.((((((.(((((((.((((((...((..(((.((((.((.(....).)).))))..))).))...)))))).))))))).))))))..)))-38.20.75 Ljm-031-3pAATCTTCATTTGAAGCTTTCGTGACTGCAGGAATCCATACTCTTTGGCTCTTTCGGTAAAGTCACGTAGGCTCATCCCCTGAT.(((......(((.((((.(((((((((.((((.(((.......)))...)))).))..))))))).)))))))......)))-21.70.59 Ljm-033-5pCTTTGGTTATTTCGGTAAAGTCACGTAGGTGCAAATTTCGGATTCCAGTACCTACGTGACTTTACCGAAAGAACCAAAGA((((((((.(((((((((((((((((((((((...............))))))))))))))))))))))).)))))))).-49.561.5 Ljm-034-3pCTTTGGTTCTTTCGGTAAAGTCGCGTAGGTACAACATGAAATAAATCACGTTATTTCGAACCTACGTGACTTTACCGAATGAACCAAAGA(((((((((.((((((((((((((((((((......((((((((......)))))))).)))))))))))))))))))).))))))))).-50.91.64 Ljm-037-5pCGCGCGGGGGAAAAGTGCAAATAGTGGTAGGTAGTGATCACTGCCGTCTGCCTACTCCATTTGCATTTTGGCCTCCGTGCGT((((((((((.(((((((((((.(..((((((((((........)).))))))))..))))))))))))..)))))))))).-46.41.03 Ljm-039-5pTTATACAGGTAACGAGCTGAGATTAGGAGAACGCTCTTAAAGGGAGTGCTCCTAAACTCAGCTTGTTACCTGTATAAA(((((((((((((((((((((.(((((((..((((((.....))))))))))))).))))))))))))))))))))).-51.81.62 Ljm-040-5pACACGTATATACCGGATTATAAGACGCACCCGCACATCATTTCCTTTAAAACGCAGGGGAAACGTGCGCCTGATGATCCGGTGAACATGGTC...(((.(.(((((((((((.((.(((((..........((((((((.......)))))))).))))).)).))))))))))).).)))...-29.20.65 Ljm-041-5pGTTGCCCATTACGGATCTGGCTTCTGAGGCTAGCAACCACTGCGTTGAGGCTAGCAACCGCTGCGTTGCT((.((.((...(((..((((((((.((.((.((......)))).))))))))))...))).)).)).)).-19.20.48 Ljm-044-5pTGTCCCGCTGAGGTCAGGATGGGCAGCAATGCGTGACTAGATCCTGTATTGCACTCGTCCCGGCCTTAGCGAGATT.(((.((((((((((.(((((((..((((((((.((.....)).)))))))).))))))).)))))))))).))).-40.70.95 Ljm-047-3pTTTTTTTCTATCTACATGACTTTACCGAAAGAAACAAAAAATATGAATTCCATACTCTTTGGTTCTTTCGGTAAAGTCATGTAGGTACAGTGAGGGAA.((((((((((((((((((((((((((((((((.((((.(.((((.....)))).).)))).)))))))))))))))))))))))))....)))))))-441.38 Ljm-049-5pTCAATGTAAACACCCTACACTCTCAGCTGTGCGCCATTGGTTAGCTGGGAGTGGGGTGTTTATGTTGACTGCCTTA(((((((((((((((..((((((((((((...(((...))))))))))))))))))))))))))))))........-40.31.09 Ljm-053-5pCACCGTAGCAGCACGTAAATATTGGAGTGTGAACTCTGCGATTCCAGTATTTCGTGCTGCTGCTGTGCGGTGGG.....((((((((((.((((((((((((((.......)).))))))))))))))))))))))............-38.80.98 Ljm-057-5pCCCACATGGTGTTGGACCAGATGACGCCACATGGTCTCACATGGTGCTGGACCAGATGACGTCACATGGTTCCACATGGTGTTGGA((.((((.((((.((((((..(((((.((..(((((((((...)))..))))))..)).)))))..)))))).)))).)))).)).-400.85 Ljm-058-5pCGTGCATTGTTAAAGTGCAGATAGTGGTAGTTGGTCCTAAAAATGACAGCTACTCTATTTACACTTTAAACACTGTGCGG((..((.((((((((((.((((((.((((((((.((........)))))))))))))))).)))))).)))).))..)).-31.80.99 Ljm-061-3pAGACAATACCTCAGAATTGTCAGGGTGCTCAGCAATCCGCACCTGACAGTGCTGGGGTTTAGTCTCAGCAGAC((((...(((((((.(((((((((.(((..........)))))))))))).)))))))...))))........-31.50.83 Ljm-063-5pTGCGCATCAGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACATCCATCTTGTAGCGAACGACCTACAGCGAACTGAGATACCTACGGCGTG.((((.(((((...((((...(((..((((((..(((.........))).))))))..))).))))..)))))..........)))).-27.30.54 Ljm-065-5pGGCTGTGCGATGAGGTAGTAGTTGTATAGTTTTTTGGGTGCAATCCCAAACGGGTAACTGTACAATCTACTGTCTTTCCCACGGCTT(((((((.((.(((..(((((((((((((((.((((((......)))))).....)))))))))).)))))..))))).))))))).-39.30.98 Ljm-066-3pGCGCGATGCCTGCCGTTTCGATCCCCGTGCCGGGAAGCTTCTTCGGGAACTGCACGTGGAGCGAAATGTTTGGCGTCACGTCG(((.((((((...(((((((.(((.(((((.(.((((...)))).....).))))).))).)))))))...)))))).)))..-35.50.68 Ljm-072-5pTTAGATCTTGTGGTGGACCTGGATGAGACAGAGTACTGAGATCGGGTCTCTCTTAAGCCCTCCACACGGTTTAT.((((((.(((((.((.(..(((.(((((.((.........))..))))))))...).)).))))).)))))).-27.10.75 Ljm-073-5pGCGAGGGTGATGTAAACATCTCAACTGGAAGCTGTGACGTCAGTAAAGGCTTTCAGTTAGGTGTTCACGTCAGCACGCTAC(((..(.((((((.(((((((.(((((((((((...((....))...)))))))))))))))))).)))))).).)))...-38.60.97

注：miRNA前體序列中加粗的部分為成熟序列；miRNA前體序列的二級結(jié)構(gòu)中，“.”表示頸環(huán)區(qū)堿基，“(”和“)”表示互補的堿基；Mfe為最小折疊自由能，MfeI為最小折疊自由能系數(shù)。

3 討 論

miRNAs是重要的基因表達調(diào)節(jié)因子，它們通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制特異的靶基因表達來行使功能。最近的研究表明，miRNA在哺乳動物先天免疫和適應性免疫兩大系統(tǒng)中具有獨特的表達譜，在免疫細胞的發(fā)育和功能的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[34]。近年來，一種平行于脊椎動物適應性免疫系統(tǒng)的以可變淋巴受體為特征的適應性免疫系統(tǒng)在七鰓鰻中被發(fā)現(xiàn)[35]，拓寬了關(guān)于適應性免疫系統(tǒng)起源與進化的研究視野。目前，對無頜類免疫系統(tǒng)免疫應答機制方面的研究還不多見，尤其是關(guān)于七鰓鰻miRNA在免疫應答過程中的調(diào)控角色及其功能研究，在國內(nèi)外尚未見報道。因此，開展七鰓鰻免疫組織中miRNA的基礎研究將對未來探索miRNA在其免疫應答過程中的調(diào)控作用奠定基礎。

高通量測序技術(shù)的興起，大大降低了基因組學研究的時間和成本，同樣為編碼及非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄組學研究的快速發(fā)展提供了可能。本文通過對日本七鰓鰻單個核白細胞的miRNA進行測序，發(fā)現(xiàn)少數(shù)保守的miRNA家族(let-7、miR-146、miR-184、miR-143、miR-30、miR-142)在七鰓鰻免疫組織中呈現(xiàn)極高豐度表達。let-7最早在線蟲中被發(fā)現(xiàn)，能夠調(diào)控細胞的分化和增殖的時序[2]；人miR-146可以調(diào)控干細胞的增殖和遷移[36]；miR-184可調(diào)控神經(jīng)細胞的發(fā)育與凋亡[37]；miR-143與鼠胚胎干細胞向心臟祖細胞的分化調(diào)控有關(guān)[38]；miR-30調(diào)節(jié)爪蟾前腎的發(fā)育過程[39]；miR-142能夠調(diào)節(jié)造血干細胞的分化[40]。這些保守miRNA家族都具有調(diào)控細胞增殖和分化的功能，推測在七鰓鰻免疫系統(tǒng)免疫應答過程中，它們對免疫細胞的活化、分化、增殖的調(diào)控過程也應該起重要作用。

本文測序結(jié)果顯示，除了物種間保守的miRNA家族外，尚發(fā)現(xiàn)七鰓鰻物種特異性miRNA的存在。對物種特異性miRNA的鑒定需要有實驗數(shù)據(jù)的支持，因此本文采用高通量的定制芯片對候選的70個miRNA進行了檢測。從芯片驗證結(jié)果看，有34個候選的miRNA在免疫處理后的日本七鰓鰻單個核白細胞中的表達情況被有效檢出，但有些miRNA的芯片檢測信號強度與測序?qū)嶒灆z測到的讀數(shù)豐度不匹配(表3)。Ljm-004、Ljm-016、Ljm-023、Ljm-049及Ljm-065芯片檢測信號較強，但測序讀數(shù)豐度較低。另外，有些在測序檢驗時較高豐度表達的miRNA(Ljm-026、Ljm-041和Ljm-044)在芯片檢測時信號較低。究其原因可能和分別送到測序和芯片測試公司的總RNA樣本在提取時間、提取的個體方面存在的差異所致。有研究認為，在高通量測序結(jié)果中，必須有 10 個拷貝以上的表達量(不含變體的表達量)來支持該小RNA的表達標準[41]。但本研究發(fā)現(xiàn)，測序讀數(shù)低于10的8種預測的物種特異的miRNA在利用定制芯片檢測時都能被有效檢測出來，并且Ljm-016、Ljm-018、Ljm-023和Ljm-072的檢測信號強度均在500以上，說明miRNA表達具有時效性。盡管目前利用qPCR作為miRNA檢測的工具具有準確、靈敏等優(yōu)點，但定制芯片檢測技術(shù)在通量和實驗成本上無疑為物種特異性miRNA的驗證提供了高效和快速的通道。

對所預測的miRNA的鑒定還要以其是否存在能折疊成較穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體序列來確定。前體序列的預測一般需要該物種基因組數(shù)據(jù)的支持。由于目前還未進行日本七鰓鰻基因組的測序，本文曾嘗試利用第二代測序技術(shù)獲得的該物種白細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行前體預測，許多新預測的miRNA也不能得到完全定位，分析原因可能是測序深度和覆蓋度不夠[42]。由于海七鰓鰻為日本七鰓鰻近緣物種，序列一致性一般在93%以上，有些保守基因甚至能達到100%一致性[45]，因此本研究采用海七鰓鰻的基因組數(shù)據(jù)作為參考基因組進行特異性miRNAs的前體鑒定。從預測結(jié)果看，在所預測的物種特異性miRNA的前體序列中，有16個最小折疊自由能系數(shù)達到0.85以上，說明這16個物種特異性miRNA符合新miRNA鑒定標準[46]。另外的18個候選miRNA的成熟miRNA可被芯片檢測驗證，但所預測的前體序列的最小折疊自由能系數(shù)均小于0.85這個閾值，可能是由于海七鰓鰻基因組數(shù)據(jù)的組裝程度較低(覆蓋率80%左右)而形成許多缺口，導致不能準確定位所致[43]。

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(責任編委: 胡松年)

The identification and verification of species-specific microRNAs and their precursors in

Xin Liu1,2, Jie Zhang1,2, Chunhui Zhao1,2, Tiesong Li1,2, Jihong Wang1,2, Qingwei Li1,2

MicroRNAs (miRNAs) negatively regulate genes which are involved in various biological processes of metabolism at both transcriptional and post-transcriptional levels. In recent years, the existence and function of miRNAs have been extensively studied in plants and animals with the application of deep sequencing and microarray technology. In this study, small RNAs from leucocytes of() were sequenced using the second generation high-throughput sequencing technology. A total of 5 207 787 small RNA sequences were identified, and 4 739 346 of them assembled into 10 989 variants. Based on sequence similarity analysis, the sequences of thesevariants matched known miRNAs of 306 conserved families, among which 6 conserved miRNA family members expressed at an extremely high level which reflected the conservatism of miRNAs among species. In addition, 70 unannotated sequences were predicted to be new miRNAs, and 34 of them were further verified expressing in antigen-treatedleucocytes by miRNA microarray assay. Moreover, the minimal folding free energy indexes for 16 of the 34 miRNA precursors exceed 0.85, indicating the existence of species-specific miRNAs inwhich may play important roles in regulating, growth, development and disease response ofleukocytes.

; species-specific miRNA; high-throughput sequencing; microarray assay

2014-11-25;

2015-01-19

國家重大基礎研究發(fā)展規(guī)劃項目(973計劃) (編號：2013CB835304)和國家自然科學基金項目(編號：31271323)資助

劉欣，教授，碩士生導師，研究方向：細胞生物學。E-mail: liuxin@lnnu.edu.cn

李慶偉，教授，博士生導師，研究方向：細胞生物學。E-mail: liqw@263.net

10.16288/j.yczz.14-411

2015-1-21 10:52:51

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150121.1052.001.html