張 靚, 張 蘭, 王曉萍

1.哈爾濱師范大學生命科學與技術學院, 哈爾濱 150025;2.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所, 北京 100081

維生素E，又稱為生育酚，是一種脂溶性分子，它分為生育酚和三烯生育酚兩種；根據(jù)芳香環(huán)上甲基的數(shù)量以及其在環(huán)上的位置不同，又分別有四種不同的組分，即α-，β-，γ-，δ-生育酚和α-，β-，γ-，δ-三烯生育酚。其中α-生育酚的活性最高且是人及動物最好吸收的。生育酚只能由植物和光合藻類合成。高等植物的種子、根、莖、葉、塊莖、下胚軸、子葉等部位均已發(fā)現(xiàn)生育酚的存在，但不同部位的含量和組成不同[1～3]。α-生育酚通常是光合組織中的主要形式，γ-生育酚在種子中的含量最高。種子中生育酚的含量通常是葉片中的10～20倍[4]。

植物已經(jīng)進化出多種機制來對抗活性氧，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和脂溶性的抗氧化劑，主要有生育酚和類胡蘿卜素[5]。在植物抗氧化功能方面，生育酚能夠有效地淬滅單線態(tài)氧，清除各種自由基尤其是脂質過氧化自由基，從而終止脂質過氧化鏈式反應[6～8]。植物的有氧代謝不斷產(chǎn)生活性氧，包括單線態(tài)氧、超氧化物、過氧化氫、羥自由基和脂質過氧化物，這是在生物脅迫和非生物脅迫中普遍產(chǎn)生的共同特性。過量活性氧的積累會對各種細胞器、質膜以及核酸、蛋白質等大分子造成損傷，最終導致細胞死亡[9]。為了防止這種現(xiàn)象，一個未知的信號轉導機制會引發(fā)多個針對抗氧化劑活性和代謝調整的基因的表達，維持活性氧濃度的穩(wěn)定。

為了提高植物的抗氧化能力，本課題組將來自大豆的維生素E合成關鍵酶基因GmTMT2a轉化到玉米中，獲得了α-生育酚含量顯著提高的轉基因玉米株系[10]，本研究對該提高玉米株系的抗氧化能力及其分子機制進行了初步的分析。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

轉GmTMT2a基因玉米(transgenic plant，TP)由本實驗室創(chuàng)制[10]，對照材料鄭58(wild type，WT)為本實驗室保存。

本研究中使用的普通化學試劑購自國藥集團化學試劑有限公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司(美國)；反轉錄試劑盒5×All in one RT Master Mix購自ABM公司(加拿大)；實時定量2×qRT PCR Mix購自TOYOBO公司(日本)。

1.2 方法

1.2.1生長條件和處理方法 種子播種于盛有蛭石的花盆中，溫室中正常生長。每盆播種4粒，待苗長至3葉期停止?jié)菜?，停水一周和兩周時取樣測定,設三組重復。

1.2.2H2O2含量測定 取0.5 g葉片研磨，加5 mL 0.1%(W/V)三氯乙酸，混勻離心12 000 g，15 min，取5 mL上清加入0.5 mL 1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)，1 mL 1 mol/L 碘化鉀，混勻后測390 nm吸光值。

H2O2(μmol/g Fw)=1+227.8×OD390[11]

1.2.3酶活性測定 粗酶液的提取：取0.5 g葉片于預冷的研缽中, 加5 mL預冷的0.05 mol/L PBS(pH 7.8)在冰浴上研磨成勻漿, 在4℃,10 000 r/min下, 離心20 min, 分離上清液, 4℃下保存?zhèn)溆?。該上清液即為酶提取液[12]。

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定：按鄒琦[13]的方法測定。取酶液0.05 mL 加入2.95 mL反應液(0.05 mmol/L PBS1.5 mL,130 mmol/L Met 0.3 mL, 750 mmol/L NBT 0.3 mL, 100 μmol/L EDTA-Na20.3 mL, 20 μmol/L 核黃素0.3 mL, 蒸餾水0.25 mL), 在4 000 lx日光下反應20 min, 在560 nm下測定光密度SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位。

過氧化氫酶(CAT)活性測定:按李合生[13]的方法測定。取酶液0.1 mL加入2.9 mL反應液(pH 7.0 Tris-HCl 1.0 mL,200 mmol/L H2O20.2 mL, 蒸餾水1.7 mL)在240 nm下測定吸光度, 每隔1 min讀數(shù)一次, 共測4 min。1 min內A240減少0.1的酶量為1個酶活單位(U)。

過氧化物酶(POD)活性測定:按李合生[14]的方法測定。取酶液1 mL加入0.1%愈創(chuàng)木酚1 mL, 蒸餾水6.9 mL, 搖勻, 最后加入0.18% H2O21.0 mL,25℃反應10 min, 加入5%偏磷酸0.1 mL, 終止反應, 并在470 nm下比色。

結果計算:以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以△A470/[min·g(鮮重)]表示，也可以用每min內A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位(U)表示。

過氧化物酶活性[U/(g·min)]=△A470×VT/(w×VS×0.01×t)

式中：△A470：反應時間內吸光度的變化。w：植物鮮重(g)。VT：提取酶液總體積(mL)。Vs：測定時取用酶液體積(mL)。t：反應時間(min)。

1.2.4抗旱基因表達量的變化 選取三種抗旱基因P5CS、P5CR和TPS。P5CS、P5CR分別是吡咯啉-5-羧酸合成酶、吡咯啉-5-羧酸還原酶，植物中P5CS對干早脅迫下的脯氨酸合成起主要作用。TPS是海藻糖-6-磷酸合酶，海藻糖廣泛存在于動物、植物和微生物中，當細胞處于逆境時，胞內海藻糖含量迅速上升，能穩(wěn)定蛋白質、核酸等生物大分子的結構，起保護劑的作用。以玉米actin1基因作為內參。應用Primer 5設計引物，進行實時定量PCR分析(qRT-PCR)。引物序列見表1。

2 結果與分析

2.1 H2O2含量變化

在正常生長條件下，TP和WT植株的H2O2含量無明顯差異，干旱處理后，TP和WT植株的H2O2含量均有所增加，但TP植株增加至正常情況下的1.2倍；而WT植株增加至約1.8倍(圖1)，表明α-生育酚含量提高的TP植株在逆境條件下清除活性氧的能力高于WT植株。

表1 PCR擴增引物Table 1 Sequence of primers for PCR amplification.

2.2 抗氧化酶活性變化

為了分析轉基因玉米中α-生育酚的提高對體內的抗氧化酶類活性的影響，分別對SOD、POD和CAT的酶活進行了測定(圖2)。在正常生長情況下，TP和WT植株中的SOD、POD和CAT的酶活性都相對較低，而且無顯著差異；在干旱處理以后，SOD的活性沒有顯著變化；POD的酶活性無論是在TP植株還是WT植株中，其增幅都約為42%。CAT酶活性增幅最大，WT植株中提高了350%,TP植株中提高了467%，而且兩者達到了極顯著差異，這也與上述轉基因植株中H2O2含量較低相一致，CAT酶活性提高，H2O2含量降低。推測逆境條件下α-生育酚的提高能夠促進CAT的表達。

圖1 干旱處理條件下H2O2含量測定Fig.1 Analysis of H2O2 content under drought stress.

圖2 干旱處理條件下SOD(A)、POD(B)、CAT(C)酶活性測定Fig.2 Enzyme activity of SOD(A), POD(B), CAT(C) under drought stress.

2.3 抗旱基因的qRT-PCR結果

為了分析其他抗旱基因在轉基因植株中是否受到α-生育酚提高的影響，對其中的3個基因的表達進行了分析(圖3)。結果表明，經(jīng)過兩周的干旱處理，無論是TP植株還是WT植株中，三個基因均是先下調表達，再上調表達。P5CS基因在處理一周后，在WT植株和TP植株中的表達量分別變?yōu)樘幚砬暗?8%和45%，而在處理兩周后表達量則分別上升為處理前的1.4倍和1.6倍，在轉基因和野生型玉米之間沒有顯著性變化。P5CR基因在處理一周后，在WT植株和TP植株中的表達量分別變?yōu)樘幚砬暗?8%和44%，處理兩周后表達量則為處理前的1.6倍和2.6倍。TPS基因在處理一周后，在WT植株和TP植株中的表達量分別變?yōu)樘幚砬暗?9%和27%，處理兩周后的表達量分別為處理前的2.2倍和4.1倍。結果表明在干旱條件下α-生育酚的提高能夠促進P5CR和TPS基因的表達。

圖3 干旱處理條件下逆境相關基因的表達分析Fig.3 Expression analysis of drought-tolerance genes under drought stress.A:P5CS; B:P5CR; C:TPS

3 討論

植物在干旱等非生物逆境條件下會產(chǎn)生大量的活性氧，導致氧化逆境，為此植物進化形成了多個抗氧化逆境的機制，包括抗氧化酶類以及抗氧化小分子物質如維生素E、維生素C和谷胱甘肽等，生育酚是其中一種有效地抗氧化分子。它可以淬滅單線態(tài)氧，清除各種自由基。在生育酚的四種形式中，α-生育酚是抗脂質過氧化最有效的組分。Collakova等[15]通過提高擬南芥中的生育酚含量提高了植株對強光及高溫低溫等的耐受性。2010年，Yusuf等[16]通過提高芥菜中的α-生育酚提高了植株對高鹽和重金屬的耐受性。2015年，Bimal等[17]通過提高紫蘇中的α-生育酚提高了植株的抗氧化活性。本研究表明，過表達GmTMT2a提高了玉米α-生育酚含量，同時其抗氧化能力得到了明顯提高。

為了進一步探討干旱條件下轉基因玉米H2O2降低的分子機制，對抗氧化相關的酶類 SOD、POD和CAT的酶活性進行了測定，其中只有CAT在轉基因玉米中的表達提高最為顯著，而CAT可以分解H2O2;此外干旱條件下在轉基因玉米中抗?jié)B透脅迫相關的基因PC5S和TPS的表達也有顯著提高。綜合上述結果，推測α-生育酚對植株抗逆性的影響包括兩方面：一是α-生育酚的提高能夠促進CAT的表達，進而導致過氧化氫含量的下降，表現(xiàn)為植物抗氧化能力的增強；另一方面是α-生育酚的提高促進了一些滲透脅迫相關基因的表達，從而提高了植株的抗?jié)B透脅迫能力，抗逆性增強。至于α-生育酚如何促進抗逆相關基因CAT、PC5S和TPS的表達還有待進一步研究。

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