王姣姣, 耿圓圓, 張家耀, 姜 偉

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院, 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193;2.湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院肝膽外科, 湖北 恩施 445000

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種具有較高發(fā)病率及死亡率的惡性腫瘤，在中國(guó)肝細(xì)胞癌的死亡率僅次于胃癌和食道癌[1]。目前對(duì)于肝細(xì)胞癌的治療以肝切除和肝移植為主，然而治療效果不容樂觀。臨床上發(fā)現(xiàn)進(jìn)行過肝移植的病人后期仍可能出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，增加了臨床上治療的難度。肝細(xì)胞癌治療術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)60%～70%，小肝細(xì)胞癌達(dá)43.5%，肝移植術(shù)后1年的復(fù)發(fā)率達(dá)50%～70%。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因是脫落的肝癌細(xì)胞極易通過血液傳播，在手術(shù)前肝細(xì)胞癌患者的血液中極可能已經(jīng)有可轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞存在，手術(shù)后存在于血液中的癌細(xì)胞可以重新回到原組織引發(fā)癌癥[2]，這種被稱為“self-seeding”的機(jī)制為患者術(shù)后治療埋下了隱患。

1869年，澳大利亞學(xué)者Ashworth發(fā)現(xiàn)死于轉(zhuǎn)移癌患者的血液中存在有一種與原發(fā)腫瘤相似的細(xì)胞，首次提出了循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)的概念[3]。由于某些自發(fā)的因素或手術(shù)過程中的操作，使位于實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶中的某些細(xì)胞釋放到外周血中，這些進(jìn)入血液中的腫瘤細(xì)胞稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。CTCs是高度異質(zhì)性的癌細(xì)胞群，根據(jù)CTCs中某些分子的變化可以確定腫瘤形成的根源，也可以追蹤腫瘤轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞免疫表型的變化等，為患者提供個(gè)性化的治療方案[4,5]。目前認(rèn)為，CTCs是惡性腫瘤進(jìn)行遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的起始階段，與患者的預(yù)后關(guān)系密切。肝癌細(xì)胞易于侵犯血管，在血管內(nèi)或其他器官形成轉(zhuǎn)移灶。對(duì)于肝細(xì)胞癌CTCs的研究已成為了解肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)機(jī)制的重點(diǎn)。然而CTCs在血液中含量甚微，約幾億個(gè)正常的細(xì)胞中才存在一個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，這是由于進(jìn)入外周血的大部分癌細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)死亡，只有極少數(shù)活力高、轉(zhuǎn)移力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞存活下來。因此收集并檢測(cè)血液中含量極少的CTCs十分困難，需要敏感的檢測(cè)方法和特異性的標(biāo)志物。本文就用于檢測(cè)CTCs的標(biāo)志物及檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述，以期為腫瘤轉(zhuǎn)移的早期檢測(cè)等研究提供參考。

1 CTCs的標(biāo)志物

正常的肝細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞后，癌細(xì)胞可以合成與之相關(guān)的多種蛋白質(zhì)、多肽和酶類，相應(yīng)的mRNA含量有所增加，這些物質(zhì)對(duì)肝癌細(xì)胞具有一定的特異性，利用這些特異性物質(zhì)可以檢測(cè)血液中CTCs的存在。

1.1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3, GPC3)

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3是硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族中的一員，通過糖基化的磷脂酰肌醇錨定在細(xì)胞質(zhì)膜的外表面，參與細(xì)胞的遷移、增殖及調(diào)控細(xì)胞存活等[6]。GPC3在肝癌細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)，在大部分非癌組織中基本不表達(dá)或表達(dá)水平極低。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在191位HCC患者中大約有74.8%的患者呈GPC3陽性，在154位非腫瘤患者中只有約3.2%的受試者呈GPC3陽性[7]。GPC3在卵巢癌、乳腺癌、間皮組織中的表達(dá)水平下調(diào)，暗示gpc3在這些器官中可能作為抑癌基因存在[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織和原發(fā)性肝損傷組織相比，在HCC中GPC3 mRNA水平和蛋白質(zhì)水平有所上調(diào)，且隨著肝細(xì)胞癌的惡性發(fā)展，其表達(dá)水平逐漸升高[7]。此外研究還發(fā)現(xiàn)GPC3的檢測(cè)在甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)呈陰性的患者中也有較高的敏感性[9]。

1.2 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor, TfR)

轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，能夠與血清中的轉(zhuǎn)鐵蛋白相互作用維持機(jī)體鐵離子的平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)。TfR在正常的組織中表達(dá)水平較低，但卻在癌細(xì)胞系，如肝細(xì)胞癌、胰腺癌、血癌、肺癌和乳腺癌等中高度表達(dá)[10]。其在癌細(xì)胞中的最高表達(dá)量較正常組織高出100倍，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是鐵離子是DNA合成過程中核糖核苷酸還原酶的輔因子，TfR大量表達(dá)于癌細(xì)胞的表面，可以介導(dǎo)更多的鐵離子進(jìn)入細(xì)胞，參與DNA的合成[11]。目前臨床上主要是將TfR的抗體連接上化療藥物、毒素蛋白等物質(zhì)，通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用靶向治療多種癌癥。目前研究發(fā)現(xiàn)的TfR主要有兩種：轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TfR1)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2(TfR2)。由于TfR在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平較正常組織高，且表達(dá)程度與腫瘤的分級(jí)和階段有關(guān)[12]，相對(duì)特異性較高，因此TfR被視為一種很有效的肝細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)志物。

1.3 甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)

1956年，Bergstrand 和Czar在進(jìn)行人類胎兒血清蛋白電泳時(shí)發(fā)現(xiàn)了甲胎蛋白(AFP)[13]。AFP合成于胎兒的肝臟，在胚胎時(shí)期高度表達(dá)，出生18個(gè)月后其在血清中的含量迅速下降，而在正常的成人血液中含量甚少，但是研究發(fā)現(xiàn)在患有肝細(xì)胞癌、纖維性囊腫、慢性肝炎、肝硬化和其他癌癥(如胃腸癌、胰腺癌和卵巢生殖細(xì)胞癌等)的病人血清中AFP的表達(dá)水平明顯上調(diào)[14,15]。目前研究發(fā)現(xiàn)的AFP主要有AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3三種糖鏈異質(zhì)體，其中以AFP-L3為標(biāo)志物來檢測(cè)HCC，可以使檢測(cè)的特異性大于95%，所以AFP-L3被視為一種有效檢測(cè)HCC的標(biāo)志物；在慢性肝炎及肝硬化患者體內(nèi)，利用AFP-L3能夠檢測(cè)到直徑小于2 cm的肝腫瘤，能夠提前9～12個(gè)月檢測(cè)到肝硬化病人體內(nèi)HCC的出現(xiàn)[16]。但是還沒有相關(guān)研究表明AFP水平與HCC發(fā)展過程中CTCs的相互關(guān)系。通過RT-PCR方法檢測(cè)血液中AFP mRNA的含量可以反映CTCs的存在，它是HCC胞外轉(zhuǎn)移的敏感標(biāo)志物。有實(shí)驗(yàn)表明，在40%的HCC患者及18%的非HCC患者體內(nèi)檢測(cè)到AFP mRNA呈陽性，且血液中AFP mRNA的水平明顯與腫瘤的大小、血管入侵及HCC的分化程度密切相關(guān)[17]。但也有研究表明在慢性乙型肝炎、肝硬化，甚至健康組織中也可以檢測(cè)到AFP mRNA呈陽性[18]。

1.4 α-L巖藻糖苷酶 (α-L-fucosidase, AFU)

α-L巖藻糖苷酶是存在于所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體酶，參與多種巖藻糖復(fù)合物的降解過程[19]。有研究報(bào)道AFU在慢性肝硬化及HCC中表達(dá)上調(diào)，之后其成為一種有效的腫瘤標(biāo)志物[20]。有研究表明在76.6%的原發(fā)性肝細(xì)胞癌中，AFU的表達(dá)水平明顯增加，其含量與腫瘤的瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(tumor node metastasis，TNM)的階段有關(guān)，表明AFU在檢測(cè)原發(fā)性肝細(xì)胞癌方面起著重要作用[21]。還有研究表明AFU的表達(dá)在HCC患者體內(nèi)明顯上調(diào)，其檢測(cè)的敏感性和特異性分別為72%和78%[22]；此外還發(fā)現(xiàn)在低表達(dá)AFP的肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)AFU陽性率為81.8%，在高度表達(dá)AFP的肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)AFU的陽性率為93.9%，因此血清中的AFU成為一種有效的HCC標(biāo)志物，且在低表達(dá)AFP的HCC呈陰性的患者體內(nèi)也有較高的檢出率[23]。

1.5 上皮細(xì)胞粘附因子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)

上皮細(xì)胞粘附因子屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，是一種腫瘤相關(guān)蛋白，在胚胎時(shí)期高度表達(dá)，并且表達(dá)水平隨發(fā)育過程而發(fā)生改變，在細(xì)胞間粘附、形態(tài)建成、細(xì)胞增殖分化方面發(fā)揮重要作用。有研究表明EpCAM從8周開始在肝前體細(xì)胞中呈陽性表達(dá)，而在成熟的肝細(xì)胞中EpCAM通常不表達(dá)[24]；在大約45.3%的HCC患者中EpCAM呈高度表達(dá)狀態(tài)[25]，此外在食管癌、胃腺癌、結(jié)腸直腸癌、子宮頸癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌等癌癥中均呈陽性表達(dá)。盡管EpCAM是一種上皮細(xì)胞特異性的粘附分子，廣泛地表達(dá)于上皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞起源的腫瘤細(xì)胞表面，但是其在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的表達(dá)量會(huì)有所下調(diào)[26]。基于檢測(cè)EpCAM的方法可能會(huì)產(chǎn)生假陰性的結(jié)果；而一些上皮細(xì)胞也可以因操作過程進(jìn)入外周血中，產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。

1.6 高爾基蛋白73(golgi protein, GP73)

高爾基蛋白73，又稱為Ⅱ型高爾基體 (golgi phosphoprotein 2, GOLPH2)，是位于高爾基體順面膜囊上的上皮細(xì)胞特異性膜蛋白[27]。研究表明GP73主要表達(dá)于正常肝組織的膽管上皮細(xì)胞，而在正常肝細(xì)胞中表達(dá)量很低或基本不表達(dá)；但是在一些慢性疾病如肝炎及肝硬化，尤其是HCC中的表達(dá)水平明顯上調(diào)[28～30]。同時(shí)研究表明GP73的表達(dá)水平與年齡、性別、HBV感染、肝外轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及數(shù)量無關(guān)[31]，因此GP73是一種潛在的有效檢測(cè)HCC的標(biāo)志物。有研究表明,與HCC的有效標(biāo)志物AFP相比，GP73檢測(cè)HCC的敏感性(76%)明顯高于AFP(70%)，但GP73的特異性(86%)要低于AFP(89%)[32]。

1.7 異常凝血酶原(des-gamma-carboxy prothrombin, DCP)

異常凝血酶原又稱為PIVKA-Ⅱ (prothrombin induced by vitamin K absence-Ⅱ)。正常的凝血酶原在肝臟合成后，由維生素K依賴性的羧化酶進(jìn)行翻譯后修飾，即將凝血酶原N-末端10個(gè)谷氨酸殘基轉(zhuǎn)化為γ-羧基谷氨酸殘基，而DCP是由于機(jī)體在缺乏維生素K的情況下不能進(jìn)行羧基化作用而產(chǎn)生不正常的凝血酶原，因此它不具備凝血活性[33]。1984年， Liebman等[34]首次報(bào)道了DCP檢測(cè)HCC的有效性，之后DCP就被廣泛作為一種有效的肝細(xì)胞癌腫瘤標(biāo)志物用于臨床研究。有研究表明DCP作為腫瘤標(biāo)志物用來檢測(cè)HCC的敏感性及特異性分別為40%～54%和81%～98%[35]。此外有報(bào)道表明AFP與DCP兩者之間并無相關(guān)性，將兩者結(jié)合使用來檢測(cè)HCC，可以使檢測(cè)的敏感性由單獨(dú)使用AFP的28.7%～54.9%增加至63.4%～78%[36]。

2 CTCs的檢測(cè)

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前用于檢測(cè)CTCs的方法有很多種，而檢測(cè)CTCs的方法主要涉及兩個(gè)過程：CTCs的富集和CTCs的檢測(cè)。由于CTCs在外周血中的含量甚少，為了提高檢測(cè)的靈敏性，通常會(huì)先對(duì)CTCs進(jìn)行富集。從血液中富集含量較少的CTCs的方法一方面包括依據(jù)細(xì)胞的物理化學(xué)等特性進(jìn)行富集的非特異性方法；另一方面包括依據(jù)細(xì)胞本身及細(xì)胞表面的標(biāo)志物等特性進(jìn)行的特異性富集方法[37]。而CTCs的檢測(cè)主要依據(jù)細(xì)胞本身的形態(tài)學(xué)特征及其存在的標(biāo)志物來發(fā)現(xiàn)CTCs。每種方法都有其局限性，目前臨床上通常綜合運(yùn)用多種方法來克服每種方法的局限性。

2.1 非特異性富集方法

2.1.1密度梯度離心法 目前常用于分離CTCs的商品化的分離液為聚蔗糖(ficoll)-泛影鈉[38]。該方法分離細(xì)胞的原理是血液中各種細(xì)胞具有不同的密度，通過離心可將它們進(jìn)行分離，從而達(dá)到富集CTCs的目的。將血液樣品直接放置于密度梯度材料上，離心后自下而上分別為紅細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞(上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞)。值得注意的是血液樣品易與分離液混合，妨礙目的細(xì)胞的分離，從而影響富集效果。OncoQuick是在Ficoll基礎(chǔ)上建立的一種可以有效防止血液樣品與分離液混合的分離目的細(xì)胞的方法[39]，其使用50 mL的專用錐形離心管，內(nèi)部設(shè)計(jì)有多孔篩，離心前將血液樣品放置于多孔篩上，避免了樣品與分離液的混雜。實(shí)驗(yàn)表明使用OncoQuick、Ficoll方法可以使血液中腫瘤細(xì)胞的回收率達(dá)到70%～90%[39]。在對(duì)富集的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)OncoQuick分離法比Ficoll分離法具有更高的回收率且更容易從血液中富集到腫瘤細(xì)胞，使一些后續(xù)試驗(yàn)如細(xì)胞的染色、免疫標(biāo)記和分子研究更加容易進(jìn)行[40]。密度梯度離心法的優(yōu)點(diǎn)在于其可以在不破壞細(xì)胞完整形態(tài)的基礎(chǔ)上分離目的細(xì)胞，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)；其缺點(diǎn)是在分離的過程中會(huì)喪失一部分目的細(xì)胞，缺乏特異性及敏感性[41]。

2.1.2依據(jù)細(xì)胞大小的膜過濾法 基于外周血中大部分的血細(xì)胞較腫瘤細(xì)胞小，可以通過一定孔徑的聚碳酸酯膜將腫瘤細(xì)胞進(jìn)行分離的一種非特異性的方法，ISET(the isolation by size of epithelial tumor cells)是目前常用的一種膜過濾法。該方法既不要求功能修飾也不需要復(fù)雜的富集程序，通過直徑為8 μm的濾膜可以有效地富集外周血中的腫瘤細(xì)胞[42]。用ISET分離到的CTCs具有明顯的細(xì)胞病理學(xué)特征，而又因?yàn)榧?xì)胞的形態(tài)保留，通過細(xì)胞染色及細(xì)胞病理學(xué)檢測(cè)，很容易區(qū)分腫瘤細(xì)胞及非腫瘤的上皮細(xì)胞，但是這種方法仍然會(huì)出現(xiàn)假陽性和假陰性的結(jié)果；此外又無研究表明所有腫瘤細(xì)胞的直徑都大于8 μm，也無法排除直徑大于8 μm的血細(xì)胞的存在，對(duì)其結(jié)果需進(jìn)一步分析[1]。此方法操作簡(jiǎn)便，在不破壞細(xì)胞形態(tài)的基礎(chǔ)上對(duì)細(xì)胞進(jìn)行富集，對(duì)收集到的細(xì)胞通過細(xì)胞染色、免疫標(biāo)記、FISH等實(shí)驗(yàn)來分析它們的抗原性、異倍體性和細(xì)胞凋亡的速率等。

2.2 特異性富集方法

免疫磁性分離法，即通過構(gòu)建的磁珠-抗體來特異性地識(shí)別目的抗原，形成“磁珠-抗靶目標(biāo)抗體-靶目標(biāo)”復(fù)合物，在外加磁場(chǎng)的作用下，將靶目標(biāo)從樣品中分離出來用于隨后的實(shí)驗(yàn)分析的一種技術(shù)。據(jù)報(bào)道目前商業(yè)用篩選靶目標(biāo)的磁珠有兩種，即陽性篩選磁珠和陰性篩選磁珠[43]，陽性篩選是將抗靶目標(biāo)細(xì)胞的抗體包被于磁珠上，通過特異性識(shí)別靶目標(biāo)將目的細(xì)胞進(jìn)行分離，此篩選效率受靶細(xì)胞抗原表達(dá)水平的影響，CTCs由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性而不表達(dá)某種特異性標(biāo)志物，易造成假陰性的結(jié)果[44]，此外通過上皮細(xì)胞特異性抗體篩選CTCs可標(biāo)記非腫瘤的上皮細(xì)胞，造成假陽性的結(jié)果；陰性篩選通過運(yùn)用抗CD-45抗體排除血液中大多數(shù)白細(xì)胞的干擾[45]。該技術(shù)是一種特異性較強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單且有效分離靶目標(biāo)的方法。被分離的CTCs保持了細(xì)胞的完整性，有利于CTCs的記數(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn)和免疫熒光試驗(yàn)等的進(jìn)行。

2.3 CTCs的檢測(cè)方法

2.3.1cellsearch系統(tǒng)檢測(cè) 它是唯一受FDA認(rèn)可的集篩選與檢測(cè)為一體的自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)，廣泛用于檢測(cè)前列腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌患者外周血中的CTCs[46]。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都表達(dá)上皮細(xì)胞特異性表面抗原EpCAM，cellsearch 系統(tǒng)就是通過包被有抗EpCAM的特異性抗體的納米磁顆粒在磁性區(qū)域捕獲CTCs，通過三重染色過程使CTCs區(qū)別于血細(xì)胞，包括用熒光素標(biāo)記CD45的抗體來標(biāo)記白細(xì)胞，用熒光素標(biāo)記角蛋白(CK)的抗體來標(biāo)記CTCs及用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，并將CD45呈陰性、CK呈陽性、EpCAM呈陽性的細(xì)胞定義為CTCs。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于回收效率可達(dá)82%以上，是國(guó)際上認(rèn)為最可靠的檢測(cè)CTCs的系統(tǒng)，但該系統(tǒng)無法檢測(cè)到表達(dá)特異性上皮細(xì)胞抗原水平較低及不表達(dá)的CTCs[47]，會(huì)造成假陰性的結(jié)果，此外富集到的CTCs為死細(xì)胞，無法回收進(jìn)行下一步培養(yǎng)。

2.3.2流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry) 它是一種基于熒光激活細(xì)胞分選(FACS)技術(shù)的細(xì)胞分析及分選技術(shù)，其原理是通過熒光素與特異性的腫瘤細(xì)胞抗體結(jié)合，使靶細(xì)胞帶上熒光素信號(hào)，然后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析及分選。與免疫組織化學(xué)法及RT-PCR相比，流式細(xì)胞術(shù)不但能夠給出高度精確的數(shù)據(jù)結(jié)果及細(xì)胞亞群的信息，而且還能夠測(cè)定細(xì)胞的形態(tài)、放大免疫、鑒定細(xì)胞抗原性及快速地分析單個(gè)細(xì)胞，但其檢測(cè)的效率依賴于細(xì)胞的數(shù)目，且價(jià)格昂貴、耗時(shí)長(zhǎng)[48]。

2.3.3逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse-transcriptase PCR，RT-PCR) 它是一種通過檢測(cè)腫瘤細(xì)胞特異性表達(dá)的mRNA水平來判斷目的細(xì)胞存在與否的方法。由于腫瘤上皮特異性或組織特異性標(biāo)記物的mRNA在外周血細(xì)胞中不表達(dá)，因此通過檢測(cè)進(jìn)入血液中的腫瘤細(xì)胞的特定mRNA表達(dá)量來間接反映CTCs的存在情況[37]。該技術(shù)主要是將腫瘤特異性的mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，通過cDNA基因擴(kuò)增后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。其優(yōu)點(diǎn)在于用該方法檢測(cè)到CTCs的敏感性要比免疫介導(dǎo)的檢測(cè)方法和細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)的敏感性高很多[49]；如果某個(gè)靶基因是典型的上皮細(xì)胞表達(dá)基因，由于一些操作原因會(huì)造成血液中出現(xiàn)非腫瘤的上皮細(xì)胞，造成假陽性結(jié)果[50]。

2.3.4CTC-chip 它是最近研發(fā)的一種具有創(chuàng)造性的技術(shù)，基于微流體技術(shù)來有效地、可重復(fù)性地分離上皮腫瘤患者血液中罕見的CTCs[51]。第一代CTC芯片是在一張尺寸大小與標(biāo)準(zhǔn)載玻片相當(dāng)?shù)墓杵细采w幾萬個(gè)顯微位點(diǎn)，每一個(gè)位點(diǎn)通過化學(xué)作用結(jié)合上抗EpCAM的抗體，依靠抗原與抗體之間的特異性捕獲CTCs。CTC芯片在檢測(cè)直腸癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌的敏感性可以達(dá)到99.1%，特異性可達(dá)100%[37]；但這種設(shè)計(jì)不但制造上有難度，而且價(jià)格昂貴。隨后馬薩諸塞州總醫(yī)院的研究人員研發(fā)出了第二代CTC芯片，命名為HB芯片。第二代的HB芯片通過將顯微位點(diǎn)設(shè)計(jì)成腓骨狀，增大了腫瘤細(xì)胞與抗體的接觸幾率，使腫瘤細(xì)胞的捕捉效率更高，獲得的結(jié)果更加全面可靠[52]。研究人員表明，HB芯片捕獲CTCs的效率相比第一代芯片提高了25%，可捕獲血液樣品中超過90%的腫瘤細(xì)胞[52]。

2.3.5酶聯(lián)免疫上皮斑點(diǎn)法(enzyme-linked epithelial immunospot assay, ELISPOT) 該技術(shù)是在酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展的一種檢測(cè)CTCs的方法，能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌情況。其原理是根據(jù)細(xì)胞可以特異性分泌某種蛋白，與連有熒光的抗體特異性結(jié)合后通過熒光檢測(cè)可確定是否存在目的細(xì)胞。使用此方法需要先去除CD45呈陽性的細(xì)胞，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白呈陽性的細(xì)胞進(jìn)行富集[53]，從而對(duì)分泌特異性蛋白的 CTCs進(jìn)一步檢測(cè)，但這種方法目前還沒有進(jìn)行大量的臨床試驗(yàn)[52]。

2.3.6免疫細(xì)胞化學(xué)法(immunocytochemistry，ICC) 該技術(shù)是將免疫學(xué)與細(xì)胞化學(xué)相結(jié)合所構(gòu)建的新技術(shù)，即將連有熒光素的特異性抗體與腫瘤細(xì)胞表面的特異性標(biāo)記物相互作用，利用熒光的強(qiáng)弱對(duì)其目標(biāo)物進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)在于可以分析細(xì)胞的大小及形態(tài)，但該方法敏感性較低，在臨床上應(yīng)用較少。在其基礎(chǔ)上發(fā)展起來的激光掃描細(xì)胞計(jì)量技術(shù)(laser scanning cytomey，LSC)可以對(duì)熒光顯微鏡下的圖像進(jìn)行連續(xù)的掃描，并通過自動(dòng)分析生成數(shù)據(jù)[54]。此方法具有高敏感、高分辨率的特點(diǎn)。同時(shí)可定性、定量及定位分析細(xì)胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)。

3 展望

CTCs在肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，但要進(jìn)一步的研究CTCs及肝細(xì)胞癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制，首先需要從血液中檢測(cè)出CTCs。雖然這方面的研究已經(jīng)呈現(xiàn)出良好的趨勢(shì)，但仍然面臨許多困難，如血液中CTCs的含量極其微少，分離困難；缺乏檢測(cè)CTCs的特異性標(biāo)志物及目前檢測(cè)CTCs的方法存在一定的局限性等，所以迫切需要找到一種更有效的檢測(cè)CTCs的方法。而作為新型納米顆粒材料的磁小體可以通過偶聯(lián)抗體來檢測(cè)肝腫瘤細(xì)胞，該技術(shù)是一種新穎的檢測(cè)方法，可能將檢測(cè)的靈敏度提高到新的水平，根據(jù)CTCs的檢測(cè)結(jié)果合理選擇治療方案、根據(jù)CTCs變化主動(dòng)調(diào)整治療方案，并進(jìn)一步研究肝細(xì)胞癌CTCs的生物學(xué)特性，為肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)，具有較好的應(yīng)用前景。

[1] Wu L J, Pan Y D, Pei X Y,etal.. Capturing circulating tumor cells of hepatocellular carcinoma [J]. Cancer Lett., 2012, 326:17-22.

[2] Paterlini-Brechot P, Benali N L. Circulating tumor cells (CTCs) detection: Clinical impact and future direction [J]. Cancer Lett., 2007, 253:180-204.

[3] Ashworth T R. A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death [J]. Med. J. Aust., 1869, 14(2):146-149.

[4] Scatena R, Bottoni P, Giardina B. Circulating tumour cells and cancer stem cells: A role for proteomics in dening the interrelationships between function, phenotype and differentiation with potential clinical applications [J]. Biochim. Biophys. Acta, 2013, 1835:129-143.

[5] Lotem J, Sachs L. Epigenetics and the plasticity of differentiation in normal and cancer stem cells [J]. Oncogene, 2006, 25:7663-7672.

[6] Feng M Q, Ho M. Glypican-3 antibodies: A new therapeutic target for liver cancer [J]. FEBS Lett., 2014, 588:377-382.

[7] Yan B, Wei J J, Zhao X L,etal.. Expression and clinicopathologic significance of glypican-3 in hepatocellular carcinoma [J]. Ann. Diagn. Pathol., 2011, 15:162-169.

[8] Kandil D H, Cooper K. Glypican-3: a novel diagnostic marker for hepatocellular carcinoma and more [J]. Adv. Anat. Pathol., 2009, 16:125-129.

[9] Fu S J, Qi C Y, Xiao W K,etal.. Glypican-3 is a potential prognostic biomarker for hepatocellular carcinoma after curative resection [J]. Surgery, 2013, 154:536-544.

[10] Calzolari A, Deaglio S, Maldi E,etal.. TfR2 expression in human colon carcinomas [J]. Blood Cells Mol. Dis., 2009, 43:243-249.

[11] 盧 燕, 石屹峰. 轉(zhuǎn)鐵蛋白受體—腫瘤的標(biāo)志物和靶向治療[J]. 生命的化學(xué), 2010, 30(2):360-363.

[12] Kawamoto M, Kohno M, Horibe T,etal.. Immunogenicity and toxicity of transferrin receptor-targeted hybrid peptide as a potent anticancer agent [J]. Cancer Chemother. Pharmacol., 2013, 71: 799-807.

[13] Abelev G I, Perova S D, Khramkova N I,etal.. Production of embryonal alpha-globulin by transplantable mouse hepatomas [J]. Transplantation, 1963, 1:174-180.

[14] Evi N D, Joris R D. Diagnosing and monitoring hepatocellular carcinoma with alpha-fetoprotein: New aspects and appications [J]. Clin. Chim. Acta, 2008, 395(1-2):19-26.

[15] Ruoslahti E, Seppala M. Demonstration of alpha-fetoprotein in serum of healthy human adults [J]. Int. J. Cancer, 1971, 8:374-383.

[16] Khien V V, Mao H V, Chinh T T,etal.. Clinical evaluation of lentil lectin-reactive alpha-fetoprotein-L3 in histology-proven hepatocellular carcinoma [J]. Int. J. Biol. Markers, 2001, 16:105-111.

[17] Sato Y, Nakata K, Kato Y,etal.. Early recognition of hepatocellular carcinoma based on altered profiles of alpha-fetoprotein [J]. N. Engl. J. Med., 1993, 328:1802-1806.

[18] Cillo U, Navagliab F, Vitale A,etal.. Clinical significance of alpha-fetoprotein mRNA in blood of patients with hepatocellular carcinoma [J]. Clin. Chim. Acta, 2004, 347: 129-138.

[19] Dicioccio R A, Barlow J J, Matta K L. Substrate specificity and other properties of alpha-L-fucosidase from human serum [J]. J. Biol. Chem., 1982, 257: 714-718.

[20] Giardina M G, Matarazzo M, Morante R,etal.. Serum a-L-fucosidase activity and early detection of hepatocellular carcinoma: a prospective study of patients with cirrhosis [J]. Cancer, 1998, 83(12):2468-2474.

[21] 魏 學(xué), 王少斌, 芮靜安. 原發(fā)性肝癌診斷中血清α-L-巖藻糖苷酶的價(jià)值[J]. 中華腫瘤雜志, 2000, 22(2):148-50.

[22] Gan Y L, Liang Q Z, Song X H. Diagnostic value of alpha-L-fucosidase for hepatocellular carcinoma: a meta-analysis [J]. Tumor Biol., 2014, 35:3953-3960.

[23] 沈 薇, 沈鼎明. 血清A-巖藻糖苷對(duì)原發(fā)性肝癌診斷價(jià)值的初步探討[J]. 中華內(nèi)科雜志, 1989, 28(7):397-399.

[24] Boer C J, Van Krieken J H, Litvinov S V,etal.. Expression of Ep-CAM in normal, regenerating, metapl-astic and neoplastic liver [J]. J. Pathol., 1999, 188(2):201-206.

[25] Chong J M, Speicher D W. Determination of disulfide bond assignment and N-glycosylation site of the human gastrointestinal carcinoma antigen GA733-2(CO17-1A, EGP, KS1-4, KSA, and Ep-CAM) [J]. J. Biol. Chem., 2001, 276(8):5804-5813.

[26] Kimura O, Kondo Y, Koqure T,etal.. Expression of Ep-CAM increases in the hepatitis B related and the treatment-resistant hepatocellular carcinoma [J/OL]. Biomed. Res. Int., 2014, http://dx.doi.org/10.1155/2014/172913.

[27] Kladney R D, Bulla G A, Guo L,etal.. GP73, a novel Golgi-localized protein upregulated by viral infection [J]. Gene, 2000, 249(1-2):53-65.

[28] Liu X, Wan X, Li Z,etal.. Golgi protein 73(GP73), a useful biomaker in liver diseases [J]. Clin. Chem. Lab. Med., 2011, 49(8):1311-1316.

[29] Liang H, Block T M, Wang M,etal.. Interleukin-6 and oncosstatin M are elevated in liver disease in conjunction with candidate hepatocellular carcinoma biomarker GP73 [J]. Cancer. Biomaker, 2012, 11 (4):161-171.

[30] Hou S C, Xiao M B, Jiang F,etal.. Serum GP73 is complementary to AFP and GGT-Ⅱ for the diagnosis of hepatocellular carcinoma [J]. Oncol. Lett., 2013, 6(4):1152-1158.

[31] 趙 巖, 陸驪工, 等. 高爾基蛋白73在肝細(xì)胞癌診斷及預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展中的作用[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 94 (5):390-392.

[32] Zhou Y, Yin X, Ying J,etal.. Golgi protein 73 versus alpha-fetoprotein as a biomarker for hepatocellular carcinoma: a diagnostic meta-analysis [J]. BMC Cancer, 2012, 12:17.

[33] Uehara S, Gotoh K, Handa H,etal.. Process of carboxylation of glutamic acid residues in the gal domain of human des-gamma-carboxyprothrombin [J]. Clin. Chim. Acta, 1999, 289:33-44.

[34] Choi G H, Han D H, Han K,etal.. Outcome after curative resection for a huge(≥10 cm)hepatocellular carcinoma and prognostic significance of gross tumor classification [J]. Am. J. Surg., 2009, 198:693-701.

[35] Mita Y, Aoyagi Y, Suzuki Y,etal.. The usefulness of determining des-gamma-carboxy prothrombin by sensitive enzyme immunoassay in the early diagnosis of patients with hepatocellular carcinoma [J]. Cancer, 1998, 82:1643-1648.

[36] Aoyagi Y, Suda T, Suzuki Y,etal.. Clinical significance of simultaneous determinations of alpha-feto-protein and des-gamma-carboxy prothrombin in monitoring recurrence in patients with hepatocellular carcinoma [J]. Cancer, 1996, 77:1781-1786.

[37] Sun Y F, Yang X R, Zhou J,etal.. Circulating tumor cells: advances in detection methods, biological issues, and clinical relevance [J]. J. Can. Res. Clin. Oncol., 2011, 137:1151-1173.

[38] Guo J, Yao F, Xu C,etal.. Detecting carcinoma cells in peripheral blood of patients with hepatocellular carcinoma by immunomagnetic beads and RT-PCR [J]. J. Clin. Gastroenterol., 2007, 41:783-788.

[39] Konigsberg R, Obermayr E, Bises G,etal.. Detection of Ep-CAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients [J]. Acta Oncol., 2011, 50:700-710.

[40] Gertler R, Rosenberg Retal.. Detection of circulating tumor cells in blood using an optimized density gradient centrifugation [A].In: Molecular Staging of Cancer[M]. Springer Berlin Heidelberg, 2003, 149-155.

[41] Balic M, Dandachi N, Hofmann G,etal.. Comparison of two methods for enumerating circulating tumor cells in carcinoma patients [J]. Cytometry B. Clin. Cytom., 2005, 68:25-30.

[42] Vona G, Sabile A, Louha M,etal.. Isolation by size of epithelial tumor cells: a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulating tumor cells [J]. Am. J. Pathol., 2000, 156(1):57-63.

[43] Pachmann K, Clement J H, Schneider C P,etal.. Standardized quantification of circulating peripheral tumor cells from lung and breast cancer [J]. Clin. Chem. Lab Med., 2005, 43(6):617-627.

[44] Goeminne J C, Guillaume T, Symmann M. Pitfalls in the detection of disseminated non-hematological tumor cells [J]. Ann. Oncol., 2000, 11(7):785-792.

[45] Cohen S J, Punt C J, Saidman B H,etal.. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer [J]. J. Clin. Oncol., 2008, 26(19) :3213-3221.

[46] Sieuwerts A M, Kraan J, Bolt J,etal.. Anti-epithelial cell adhesion molecule antibodies and the detection of circulating normal-like breast tumor cells [J]. J. Natl. Cancer Inst., 2009, 101(1):61-66.

[47] Kaiser J. Cancer’s circulation problem [J]. Science, 2010, 327:1072-1074.

[48] Wang L, Wang Y, Liu Y,etal.. Flow cytometric analysis of CK19 expression in the peripheral blood of breast carcinoma patients: relevance for circulating tumor cell detection [J]. J. Exp. Clin. Cancer Res., 2009, 28:57.

[49] Sohuler F, Dolken G. Detection and monitoring of minimal residual disease by quantitative real time PCR [J]. Clin. Chem. Acta, 2006, 363(1-2):1 47-156.

[50] Lambrechts A C, Bosma A J, Top B,etal.. Comparison of immunocytochemistry, reverse transcriptase polymerase chain reaction, and nucleic acid sequence-based amplification for the detection of circulating breast cancer cells [J]. Breast Cancer Res. Treat., 1999, 56(3):219-231.

[51] Nagrath S, Sequist L V, Smith M R,etal.. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology [J]. Nature, 2007, 450(7173):1235-1239.

[52] Stott S L, Hsu C H, Tsukrov D I,etal.. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107(43):18392-18397.

[53] Matsusaka S, Chin K, Ogura M,etal.. Circulating tumor cells as a surrogate marker for determining response to chemotherapy in patients with advanced gastric cancer [J]. Cancer Sci., 2010, 101:1067-1071.

[54] Tarnok A, Gerstner A O. Clinical applications of laser scanning cytometry [J]. Cytometry, 2002, 50(3): 133-143.