俞詩源，袁　靜，孟　茹，魏娉婷

(1．西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州　730070；

2．西北師范大學學報編輯部，甘肅蘭州730070)

山丹黃參多糖對四氯化碳損傷小鼠肝形態(tài)結(jié)構(gòu)和TNF-α表達的影響

俞詩源1，2，袁靜1，孟茹1，魏娉婷1

(1．西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州730070；

2．西北師范大學學報編輯部，甘肅蘭州730070)

摘要：研究山丹黃參多糖對四氯化碳(CCl4)致小鼠肝損傷的影響.對40只小鼠先灌胃山丹黃參多糖(12.5，25，37.5 g·L-1)和等量的生理鹽水，然后腹腔注射0.2%的CCl4橄欖油溶液，稱量小鼠體重、肝重變化，解剖觀察小鼠肝臟的形態(tài)變化，顯微鏡觀察肝組織結(jié)構(gòu)的變化，免疫組織化學法檢測TNF-α在肝組織表達的變化.研究顯示，CCl4組小鼠體重明顯減輕(P<0.01)，肝重明顯增大(P<0.01)，肝臟明顯腫脹，肝表面粗糙，有大量脂滴附著，肝臟周圍亦有脂狀物堆積；肝組織結(jié)構(gòu)不清，細胞炎性壞死，TNF-α蛋白陽性表達明顯增強(P<0.01)；山丹黃參多糖各組與CCl4組相比體重顯著或極顯著增加(P<0.05或P<0.01)，肝重明顯減小(P<0.05)，肝臟腫脹明顯減輕，肝形態(tài)正常，肝臟表面脂滴減少，肝組織結(jié)構(gòu)清晰，TNF-α蛋白陽性表達明顯減少(P<0.01).結(jié)果表明，四氯化碳對肝組織有明顯的損傷效應(yīng)，山丹黃參多糖具有減少脂質(zhì)沉著、抑制肝臟腫脹、促進肝臟機能穩(wěn)定、抑制細胞過度凋亡等作用，能有效減輕四氯化碳對肝組織的損傷.

關(guān)鍵詞：山丹黃參多糖；四氯化碳；小鼠；肝形態(tài)結(jié)構(gòu)；TNF-α

EffectsofShandanSphallerocarpus gracilispolysaccharide

四氯化碳(Carbon tetrachloride，CCl4)被廣泛用作麻醉劑、驅(qū)蟲劑、除垢劑等，在工業(yè)生產(chǎn)中主要用于制造二氯二氟甲烷和油漆、橡膠的溶劑等，是生產(chǎn)中常用的有機溶劑和民用化學品，已有研究顯示CCl4刺激粘膜、麻醉中樞神經(jīng)，對肝、腎有嚴重的損害作用，吸入高濃度的CCl4可迅速出現(xiàn)昏迷、抽搐，甚至造成室顫和呼吸中樞麻痹而猝死[1].黃參是多年生純天然植物，具有重要的藥用和食用價值，含有人體必需的各種氨基酸、有機酸、微量元素等[1,2]，具有抗氧化、鎮(zhèn)咳、增強免疫等生理功能[3-5]，但山丹黃參多糖對CCl4致小鼠肝臟代謝異常是否有影響尚未見報道，為了搞清黃參多糖對CCl4致小鼠肝代謝異常的影響，筆者通過給小鼠連續(xù)灌胃山丹黃參多糖，腹腔注射CCl4橄欖油溶液，觀察小鼠肝形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，檢測肝組織TNF-α表達的變化，研究山丹黃參多糖對小鼠肝損傷的影響，為臨床藥物損傷的治療提供依據(jù).

1材料與方法

1.1主要藥品和儀器

山丹黃參(購自甘肅省山丹軍馬場)，冷凍粉碎后按1∶60的料液比蒸餾水提取，70 ℃水浴攪拌2 h，3 000 r·min-1離心(15 min)，取上清液減壓濃縮，加三倍體積95%乙醇振蕩后靜置，3 000 r·min-1離心棄去上清液，冷凍干燥24 h至恒重，即得山丹黃參多糖，用苯酚硫酸法測得多糖含量為61.30%，用時配制成12.5，25，37.5 g·L-1山丹黃參多糖水溶液.

TNF-α抗體、免疫組織化學試劑盒和顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，四氯化碳(Carbon tetrachloride，CCl4)分析純.

高速臺式冷凍離心機(TGL-16M型，Beckman 美國)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52-05型，上海亞榮生化儀器廠)，光學顯微鏡(Olympus，F(xiàn)X-35WA，Japan).

1.2動物分組及處理

選昆明小鼠40只(20±2)g(蘭州大學第一醫(yī)學院實驗動物中心提供)，隨機分為對照組，CCl4組，山丹黃參多糖1,2,3組5個組，預(yù)飼養(yǎng)1 W后，山丹黃參多糖1，2，3組分別連續(xù)灌胃0.2mL濃度為12.5，25，37.5g·L-1的山丹黃參多糖(共28 d，每天上午10.00，下午4.00各1次)，對照組和CCl4組灌胃等量的生理鹽水.CCl4組、山丹黃參多糖1,2,3組小鼠再分別腹腔注射0.2%CCl4橄欖油溶液0.2 ml(每3天1次，共9次)，正常對照組腹腔注射等量的生理鹽水.

1.3體重和肝重檢測

小鼠灌胃或給藥后，先稱量檢測體重，再經(jīng)眼眶采血、處死，在冰袋上剖開腹腔解剖觀察肝臟的形態(tài)變化，再取肝臟用生理鹽水漂冼后，用電子天平稱量肝臟重量.

1.4光鏡觀察

將肝組織塊入15%的福爾馬林液固定，做常規(guī)石蠟包埋、切片(6 μm)，光學顯微鏡下觀察、攝片.

1.5免疫組織化學觀察

取上述肝組織切片脫蠟至水，微波處理修復(fù)后，按免疫組化試劑盒說明書，3% H2O2避光孵育以消除內(nèi)源性過氧化酶活性，山羊血清室溫孵育以封閉非特異性反應(yīng)位點，滴加TNF-α一抗4 ℃冰箱過夜，室溫孵育1 h，PBS沖洗，滴加生物素標記的二抗(羊抗兔IgG)37 ℃孵育30 min，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液室溫孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水封片，顯微鏡觀察檢測肝組織中TNF-α的表達量.

1.6數(shù)據(jù)采集與處理

從每組免疫組織化學切片中選擇形態(tài)典型的圖片10張，用Image-proplus 6.0圖像分析軟件檢測TNF-α蛋白在小鼠肝組織中陽性反應(yīng)產(chǎn)物的平均光密度.實驗數(shù)據(jù)用 SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標準差(Mean±SD)表示，兩組間均數(shù)比較(CCl4組與對照組，山丹黃參組與CCl4組)采用雙尾t檢驗，P<0.05表示差異顯著，P<0.01差異極顯著.

2結(jié)果

2.1體重及肝重的變化

山丹黃參多糖影響CCl4損傷小鼠的體重(圖1).注射CCl4后CCl4組小鼠體重下降，與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；與CCl4組相比，山丹黃參多糖各組小鼠體重均又升高，其中，山丹黃參多糖2、3組與CCl4組相比差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)；

山丹黃參多糖影響CCl4損傷小鼠的肝重(圖2).與對照組相比，CCl4組小鼠肝臟重量極顯著升高(P<0.01)；山丹黃參多糖各組小鼠肝臟重量亦有不同程度升高，但與CCl4組相比，山丹黃參多糖2、3組小鼠肝重顯著降低(P<0.05).

山丹黃參多糖影響CCl4損傷小鼠肝臟系數(shù)(圖3).與對照組相比，CCl4組小鼠肝臟系數(shù)明顯升高(P<0.01)；與CCl4組相比，山丹黃參多糖各組小鼠肝臟系數(shù)明顯降低(P<0.05或P<0.01).

圖1　小鼠體重變化

**P<0.01 與對照組比較(Compared with the control group)；#P<0.05，##P<0.01 與CCl4組比較(Compared with the CCl4group).下同(The below same)

2.2肝形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

山丹黃參多糖影響CCl4損傷小鼠肝臟的形態(tài)(圖4).對照組小鼠肝臟呈棕紅色，表面光滑，質(zhì)地柔軟，形態(tài)正常(圖4：A)；CCl4組小鼠肝臟腫大，色澤血紅，質(zhì)地變硬且表面比較粗糙，有大量顆粒狀白色脂滴，肝臟周圍亦有白色油脂狀物堆積(圖4：B)；山丹黃參多糖各組小鼠肝臟與CCl4組相比，色澤紅潤，表面光滑，肝腫脹明顯減輕，表面顆粒狀脂滴明顯減小，肝臟周圍無明顯油脂狀物堆積(圖4：C).

圖2　小鼠肝重變化

圖3　小鼠肝臟系數(shù)變化

山丹黃參多糖影響CCl4損傷小鼠肝臟的結(jié)構(gòu)(圖4).對照組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)完好，肝索呈輻射狀排列，肝細胞結(jié)構(gòu)清晰(圖4：D)；CCl4組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，肝索不清楚，肝細胞變性壞死，細胞間有大量大小不一的白色脂滴(圖4：E)；山丹黃參多糖各組隨濃度增高，小鼠肝索趨于清晰，細胞間脂滴消失，壞死細胞數(shù)減少，肝組織結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)正常(圖4：F-H).

2.3肝組織TNF-α表達的變化

圖4小鼠肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)和TNF-α表達的變化

Fig 4The change of morphology structure and expression of TNF-αof liver in mice

A.對照組小鼠肝臟，表面光滑，形態(tài)大小正常，顏色呈棕紅色；

B.CCl4組小鼠肝臟，表面粗糙，顏色鮮紅，腫大明顯，有明顯白色脂滴形成，肝臟周圍有白色脂狀物沉積(↑)；

C.山丹黃參多糖2組小鼠肝臟，表面光滑，腫脹不明顯，有少量白色脂滴(↑)，肝臟周圍無脂狀物沉積；

D.對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)，肝細胞結(jié)構(gòu)完整；

E.CCl4組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)，有大量炎性壞死細胞，細胞間可見大量大小不一的白色脂滴(↑)；

F.山丹黃參多糖1組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)，細胞間脂滴減少(↑)，有少量炎性壞死細胞(↑)；

G.山丹黃參多糖2組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)，細胞間脂滴減少至消失，有少量壞死細胞(↑)；

H.山丹黃參多糖3組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)，肝組織基本正常；

I.對照組肝組織TNF-α的表達(↑)；

J.CCl4組小鼠肝組織TNF-α的表達(↑)；

K.山丹黃參多糖 1 組小鼠肝組織TNF-α的表達(↑)；

L.山丹黃參多糖 2 組小鼠肝組織TNF-α的表達(↑)；

M.山丹黃參多糖 3 組小鼠肝組織TNF-α的表達(↑).

A.The control group mice liver，surface is smooth，shape and size is normal，presenting brownish red；

B.The CCl4group mice liver，surface is rough，presenting bright red，swollen obviously，there are obvious white fat droplets widely distributed，the liver is surrounded by some white fat deposits(↑)；

C.SGP 2 group liver，surface is smooth，there is a little white fat droplets(↑)，whithout white fat deposits surrounded．

D.The control group liver tissue，liver cells are structural integrity；

E.The CCl4group liver tissue，there are a large number of dead liver cells,a number of different sizes of white fat drops could be seen in the intercellular space(↑)；

F.SGP 1 group liver tissue，intercellular steatosis derease with focal necrosis(↑)；

G.SGP 2 group liver tissue，intercellular steatosis derease and eventually disappeare with intercellular necrosis(↑)；

H.SGP 3 group liver tissue，liver tissue structure look normally；

I.The expression of TNF-αin the liver tissue of control group；

J.The expression of TNF-αin the liver tissue of CCl4group(↑)；

K.The expression of TNF-αin the liver tissue of SGP 1 group(↑)；

L.The expression of TNF-αin the liver tissue of SGP 2 group(↑)；

M.The expression of TNF-αin the liver tissue of SGP 3 group(↑)．

免疫組織化學顯示，陽性表達部位被染成棕黃色(圖4：I~M)，TNF-α蛋白表達于肝細胞胞漿內(nèi).注射CCl4和灌胃山丹黃參多糖后各組小鼠肝

組織都有TNF-α蛋白不同程度的陽性表達，CCl4組表達顯著增加，陽性細胞數(shù)量多而密集，顯色較深(圖4：J)，山丹黃參多糖各組TNF-α蛋白亦有陽性表達，但與CCl4組相比陽性細胞較少，且表達量與多糖劑量呈負相關(guān)(圖4：K~M).TNF-α蛋白表達的平均光密度值見表1.

表1　TNF-α蛋白在小鼠肝組織中表達的平均光密度值

**P<0.01,與對照組比較(Compared with the control group)；#P<0.05，##P<0．01,與CCl4組比較(Compared with the CCl4group)

3討論

3.1山丹黃參多糖對小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

肝臟是機體內(nèi)最大的消化腺，對糖、蛋白質(zhì)、脂肪等代謝具有重大意義.γ球蛋以外的球蛋白、酶蛋白及血漿蛋白的生成、維持及調(diào)節(jié)及氨基酸代謝、許多維生素合成與儲存等均與肝臟密切相關(guān).CCl4進入體內(nèi)后可使肝臟對胰島素的降解能力降低，促使組織利用葡萄糖增加，造成血糖水平下降[6]， CCl4還可引起大鼠外周血T淋巴細胞比例和白細胞介素顯著降低，使機體血漿總蛋白和白蛋白含量下降，造成大鼠免疫失調(diào)[8]，使小鼠體重減輕.肝臟參與產(chǎn)熱和水、電解質(zhì)的調(diào)節(jié)，肝損傷時對鈉、鉀、鐵、磷等電解質(zhì)調(diào)節(jié)失衡，肝臟微循環(huán)受到影響[7]，造成肝臟重量升高.因此，腹腔注射CCl4后，小鼠體重增長緩慢、肝臟腫大、肝臟系數(shù)增加，表明肝組織結(jié)構(gòu)受到破壞造成肝內(nèi)血液循環(huán)異常，導(dǎo)致肝臟代謝紊亂、機體免疫力下降，肝臟出現(xiàn)炎性浸潤.山丹黃參富含人體必需的多種氨基酸、礦物質(zhì)和鈣、磷、鐵、鋅等微量元素[2]，可調(diào)節(jié)機體代謝活動、增強機體的免疫能力[5]，提高機體對氧自由基的清除能力[4]，灌胃不同濃度的山丹黃參多糖后，機體免疫力增強，微循環(huán)得到改善，增強了肝的代謝能力，從而降低了CCl4引起的肝臟炎性損傷，使得小鼠體重逐漸增加，肝臟系數(shù)比向正常水平恢復(fù).

3.2山丹黃參多糖對肝形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

脂肪酸分解、膽固醇與磷脂合成、脂蛋白合成等均在肝臟內(nèi)進行.肝細胞膽汁的產(chǎn)生分泌與肝臟膽固醇合成的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，膽汁酸是膽汁的重要成分，是脂類食物消化必不可少的物質(zhì)，也是機體內(nèi)膽固醇代謝的最終產(chǎn)物.膽汁酸隨膽汁流入腸道后，約有95%被腸壁重吸收回肝臟并經(jīng)肝細胞再處理后釋放[8].CCl4進入機體后，引起肝細胞膜、線粒體膜、溶酶體膜等膜類結(jié)構(gòu)的損傷[9]，導(dǎo)致肝細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，阻礙了腸肝循環(huán)，使固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白表達增加，造成肝細胞的脂肪變性[10,11]，并引起大鼠肝門靜脈壓和中心靜脈壓明顯升高[12]，破壞肝被膜，導(dǎo)致部分肝被膜出血和血纖維蛋白析出及以嗜酸性白細胞為主的炎性浸潤[13]，在炎癥的介導(dǎo)下，肝細胞攝入外源性膽固醇增加，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)的異常聚集[14].本研究顯示CCl4組小鼠肝臟表面欠光滑，周圍有白色脂狀物堆積，肝臟充血腫脹，肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞大量壞死，細胞間出現(xiàn)大量白色脂滴，表明CCl4在體內(nèi)的代謝物影響了肝臟微循環(huán)，使膽汁酸的分泌、運輸、回收等出現(xiàn)障礙，破壞了膽固醇的代謝平衡，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇.植物多糖可修復(fù)受損細胞，增強免疫細胞活性[15].本研究顯示，山丹黃參多糖各組肝臟形態(tài)趨于正常，腫脹明顯減輕，表面趨于光滑，肝臟表面脂滴明顯減小減少，周圍組織脂肪積累減少，肝組織壞死、細胞及胞間脂肪變性明顯減少，表明山丹黃參多糖對CCl4所致的肝損傷具有保護作用，其機制可能與多糖抗氧化作用、改善肝臟微循環(huán)、增加膜類結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、促進蛋白的正確合成與膽固醇的正常代謝有關(guān).

3.3山丹黃參多糖對肝組織TNF-α表達的影響

腫瘤壞死因子(Tumor cecrosis factor，TNF)對維持機體穩(wěn)態(tài)具有重要作用，一定范圍內(nèi)的TNF-α可調(diào)節(jié)機體的免疫功能，而TNF-α異常分泌又是重要的炎癥介質(zhì)，引起局部炎癥反應(yīng)和器官的損害，過量的TNF表達與肝細胞壞死呈正相關(guān)[16]，TNF-α可通過脂類介質(zhì)和氧自由基，誘導(dǎo)花生四烯酸代謝導(dǎo)致肝組織出血，激活巨噬細胞等方式引起肝損傷[17].CCl4進入機體后可改變細胞膜通透性，使水分及一些離子進入細胞內(nèi)，導(dǎo)致細胞因細胞器遭到破壞而死亡[9]，由其引起的氧化損傷會刺激TNF-α的表達，進而引起肝臟中NOS活性增加，導(dǎo)致肝內(nèi)NO含量升高，抑制線粒體呼吸，同時與氧自由基反應(yīng)生成超氧化亞硝基陰離子損傷細胞，加快了肝細胞的凋亡和壞死[18,19]，所以CCl4組小鼠肝組織TNF-α的表達量增多.肝組織壞死細胞增多.植物多糖對氧化損傷細胞具有保護和修復(fù)作用，當歸水提液可緩解CCl4所致的線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)損傷[20]，山丹黃參多糖可能通過促進肝細胞的新陳代謝，抑制超氧自由基的形成，維持細胞的能量代謝和物質(zhì)運輸?shù)韧緩綔p少TNF-α在肝組織中的表達，緩解CCl4及其代謝物對肝臟造成的損傷.

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E-mail:syyu006@nwnu.edu.cn

onthehistolomorphstructureandtheexpression

ofTNF-αproteininliverinducedbyCCl4

YUShi-yuan1,2，YUANJing1，MENG Ru1，WEIPing-ting1

(1．CollegeofLifeScience，NorthwestNormalUniversity，Lanzhou730070，Gansu,China；

2．EditorialDepartmentoftheUniversityJournal，NorthwestNormalUniversity，Lanzhou730070，Gansu,China)

Abstract:To investigate the effects of Shandan Sphallerocarpus gracilis polysaccharide(SGP) on the liver histolomorph structure and the expression of TNF-α protein in liver tissue injury induced by carbon tetrachloride(CCl4) in mice,40 mice are gavaged with 0.2 mL SGP at different concentrations(12.5，25，37.5 g·L-1) or physiological saline，and then inject intraperitoneally with doses of 0.2 mL CCl4solution(0.2 % in olive oil).The body weight and liver weight are recorded，the morphologic change of the samples are observed，and the change in the expression of TNF-α in liver tissue are determined by immunohistochemical method．Results show the body weights of CCl4group are significantly decreased，while the liver weights are increased significantly(P<0.01) and swelled markedly，surface is rough and presenting bright red.There are clear white fat droplets，the liver is surrounded by some white fat deposits，positive expression of TNF-α protein increases significantly in liver(P<0.01)．However，the body weights in the SGP groups are significantly increased(P<0.01),but the liver weights are significantly decreased(P<0.05)，the liver swollen is significantly mitigated，surface is smooth，there is a little white fat droplets，no white fat deposits around the liver，positive expression of TNF-α protein decreases significantly in liver(P<0.01)．All results indicate that CCl4has an obvious damage effect on the liver tissue.SGP can reduce lipid composure，inhibit the swollen of the liver and excessive apoptosis of liver cell,promote liver function stability，which can reduce liver tissue damage induced by carbon tetrachloride effectively．

Key words:Sphallerocarpus gracilis polysaccharide；carbon tetrachloride；mice；liver histolomorph；TNF-α

中圖分類號：R 338.21

文獻標志碼：A

文章編號：1001-988Ⅹ(2015)02-0078-07

作者簡介：俞詩源(1957—)，男，甘肅蘭州人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師.主要研究方向為發(fā)育生物學和毒理學.

基金項目:甘肅省自然科學基金資助項目(1107RJZA141);蘭州市社會發(fā)展項目(2013-3-72，2014-1-102)

收稿日期：2014-10-06;修改稿收到日期:2014-11-20