薛士鵬

·實驗研究·

結(jié)核分枝桿菌Rv1009結(jié)構(gòu)域多肽的免疫學(xué)特性研究

薛士鵬

目的 探討結(jié)核分枝桿菌Rv1009結(jié)構(gòu)域多肽的免疫學(xué)特性。方法 選取33只小白鼠按照融合蛋白免疫情況的不同分為Rv1009組、BCG組和生理鹽水組, 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測方式對三組小白鼠中的血清特異性抗體滴速情況進(jìn)行觀察。分離小白鼠的脾淋巴細(xì)胞后采用體外抗原刺激的方式和MTT比色法對小白鼠脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)進(jìn)行觀察。采用ELISA方法檢測淋巴細(xì)胞懸液中鼠源性γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)的產(chǎn)生水平。結(jié)果 經(jīng)過研究后發(fā)現(xiàn), 結(jié)核分枝桿菌Rv1009結(jié)構(gòu)域多肽免疫小白鼠血清特異性抗體的滴速為1:13800, 淋巴細(xì)胞增殖的指數(shù)為(2.42±0.17), 明顯高于生理鹽水組小白鼠的淋巴細(xì)胞增值指數(shù)(P<0.05)。在ELISA檢測方面, 結(jié)核分枝桿菌Rv1009結(jié)構(gòu)域多肽免疫組小白鼠的IFN-γ、IL-10、IL-12產(chǎn)生水平分別為(1422±31)、(502±10)、(310±12)ng/L, 明顯高于生理鹽水組小白鼠的IFN-γ、IL-10、IL-12產(chǎn)生水平(P<0.05)。結(jié)論 結(jié)核分枝桿菌Rv1009結(jié)構(gòu)域多肽在體外實驗研究的過程中效果更好, 具有極強(qiáng)的臨床研究價值。

結(jié)核分枝桿菌；Rv1009；結(jié)構(gòu)域多肽；免疫學(xué)特性

為了探討慢性胃炎的有效治療方式, 本院特進(jìn)行了一次研究, 取得了較為良好的效果, 現(xiàn)將具體情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 7H9液體培養(yǎng)液引進(jìn)于美國Difco公司；IFN-γ、IL-10和IL-12所使用的ELISA檢測試劑盒主要由深圳晶美公司提供。MTBH37RV是由陜西省結(jié)核病防治中心提供, BCG疫苗株主要由蘭州生物制藥研究所提供, 國藥準(zhǔn)字為SF20020034, 批號為20011201。RPMI1640主要購自于華美生物有限公司［1］。本次研究的主要對象為小白鼠, 所有選用的小白鼠均為雄性, 由湖南省第四軍醫(yī)大學(xué)試驗動物中心資助。33只小白鼠作為本次研究的主要對象, 將其隨機(jī)按照融合蛋白免疫情況的不同分為Rv1009組、BCG組和生理鹽水組。

1.2 研究方法

1.2.1 脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)檢測試驗 分離三組小白鼠的脾淋巴細(xì)胞, 并將細(xì)胞數(shù)量調(diào)整到5×105/L, 200 μl/孔, 在孔板中用小牛血清對RPMI-1640進(jìn)行培養(yǎng), 并且加入PPD2 μg/孔,但是在對照孔中不加入PPD, 調(diào)零孔不加細(xì)胞。將其放置在孵箱中進(jìn)行培養(yǎng), 再加入20 μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng),棄上清后再在孔板中加入DMSO震蕩10 min后測算相關(guān)的刺激指數(shù)。

1.2.2 小白鼠血清中特異性抗體檢測方式 用純化的方式將融合蛋白作為抗原, 包被ELISA板, 在4℃環(huán)境下過夜之后將37℃的環(huán)境下封閉, 30 min之后洗滌, 并且加入不同稀釋度的免疫小白鼠的血清, 洗滌后加HRP標(biāo)記的羊抗鼠。待OPD顯色之后測定490 nm處的吸光度值。

1.3 觀察指標(biāo) 三組小白鼠中的血清特異性抗體滴速、脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)情況、淋巴細(xì)胞懸液中IFN-γ、IL-10、IL-12的產(chǎn)生水平進(jìn)行觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)核分枝桿菌Rv1009結(jié)構(gòu)域多肽免疫小白鼠血清特異性抗體的滴速為1:13800, 淋巴細(xì)胞增殖的指數(shù)為(2.42± 0.17), 生理鹽水組小白鼠的淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)為(0.91±0.13)。比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)核分枝桿菌Rv1009結(jié)構(gòu)域多肽免疫組小白鼠的IFN-γ、IL-10、IL-12產(chǎn)生水平分別為(1422±31)、(502±10)、(310±12)ng/L, 生理鹽水組小白鼠的IFN-γ、IL-10、IL-12產(chǎn)生水平分別為(255±20)、(75±5)、(55±7)ng/L, 比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

結(jié)核疾病英文名稱為tuberculosis, 簡稱為TB, 是目前世界范圍內(nèi)最為重要的致病因素, 患者很容易產(chǎn)生死亡的情況［2］。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計顯示, 在全世界范圍內(nèi), 約有33%的人群感染結(jié)核分枝桿菌的情況, 發(fā)生結(jié)核分枝桿菌感染的情況的新增人數(shù)每年約有1500萬, 大約250萬患者發(fā)生死亡的情況［3］。從目前結(jié)核分枝桿菌的存在形式上來看主要是潛伏感染, 從這一方面可以證明, 結(jié)核分枝桿菌耐藥性能較強(qiáng), 可以在體內(nèi)長期生存, 這一特點也是造成近幾年來結(jié)核疾病在臨床中呈現(xiàn)出上升趨勢的重要原因, 因此對隱藏性結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行控制是臨床中最為重要的方面［4］。從目前臨床情況上來看卡介苗是預(yù)防結(jié)核分枝桿菌主要的預(yù)防疫苗, 但是這種疫苗在臨床中所表現(xiàn)出的保護(hù)期較短, 免疫應(yīng)答能力較弱。另外還需要注意的是, 卡介苗對結(jié)核隱性感染者并沒有效果。因此找到一種能夠替代卡介苗的疫苗成為國內(nèi)外研究的重點問題。通過本次研究發(fā)現(xiàn), 結(jié)核分枝桿菌Rv1009在生長的過程中發(fā)揮出重要的作用, 具有多種淋巴細(xì)胞抗原表位的特點, 是治療結(jié)核疾病新的切入點。從本次研究的結(jié)果上來看,在小白鼠血清中能夠檢測到較強(qiáng)的結(jié)核分枝桿菌Rv1009結(jié)構(gòu)域多肽抗體, 因此證明此種免疫方式的可行性［5］。

綜上所述, 結(jié)核分枝桿菌Rv1009結(jié)構(gòu)域多肽在體外實驗研究的過程中能夠取得良好的效果, 很有可能成為未來新型的結(jié)核疫苗之一, 具有極強(qiáng)的臨床研究價值, 本次研究中的結(jié)果值得在臨床中大力推廣應(yīng)用。

［1］ 樊愛琳, 師長宏, 蘇明權(quán), 等.結(jié)核分枝桿菌Rv1009結(jié)構(gòu)域多肽的免疫學(xué)特性研究 .中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 31(11):1282-1286.

［2］ 樊愛琳, 馬越云.抗結(jié)核分枝桿菌RpfB結(jié)構(gòu)域單克隆抗體的制備及鑒定.生物技術(shù)通訊, 2014, 25(6):804-808.

［3］ 蒯守剛, 崔振玲.結(jié)核分枝桿菌Rv3671c基因的克隆表達(dá)及免疫印跡檢測.臨床檢驗雜志, 2012, 30(11):906-908.

［4］ 霍如松.結(jié)核分枝桿菌Rv1738、TB31.7及RPFE的表達(dá)純化及免疫特性分析.揚州大學(xué), 2012.

［5］ 曹廷明, 賈紅彥, 杜鳳嬌, 等.結(jié)核分枝桿菌Rv1512基因的特異性和克隆表達(dá).臨床肺科雜志, 2011, 16(12):1887-1890.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.17.191

2015-01-30］

473061 南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校