張曉明

慢性肝病患者血中TPO、PAIgG檢測的意義

張曉明

目的探討在慢性乙型肝炎(乙肝)、乙肝肝硬化血小板減少發(fā)病機(jī)制中血小板生成素(TPO)、血小板相關(guān)免疫球蛋白G(PAIgG)的作用。方法 115例慢性乙肝(CHB組, 52例)、乙肝肝硬化(LC組, 63例)伴血小板減少患者及57例健康獻(xiàn)血者(CTL組)采取靜脈血酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(ELISA)法檢測TPO、PAIgG水平。結(jié)果 慢性乙肝患者TPO輕度升高、PAIgG水平明顯升高；肝硬化患者PAIgG水平明顯升高, TPO水平明顯下降；患者與CTL組比較除慢性乙肝患者TPO外, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論 PAIgG參與了慢性乙肝、乙肝肝硬化伴血小板減少的發(fā)?。欢斡不难“鍦p少機(jī)制還與TPO生成減少有關(guān)。

慢性乙型肝炎；肝硬化；血小板生成素；血小板相關(guān)免疫球蛋白G

病毒性肝炎患者合并血小板減少十分常見, 在各型慢性肝炎和肝硬化中的發(fā)生率為37%～77%［1,2］。脾大及脾功能亢進(jìn)是慢性肝病血小板減少的主要原因［3,4］。但慢性肝病患者血小板減少的程度與脾大、脾亢的程度并不總是平行的。本文通過檢測慢性肝病患者血中TPO、PAIgG水平, 就其發(fā)病機(jī)制做一些探討, 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取115例慢性乙肝、乙肝肝硬化伴血小板減少患者, 經(jīng)3次檢測外周血小板計(jì)數(shù)＜100×109/L為入選對(duì)象, 其中慢性乙肝伴血小板減少(CHB組)患者52例,乙肝肝硬化伴血小板減少(LC組)患者63例, 均為按全國第五次肝炎會(huì)議擬訂標(biāo)準(zhǔn)診斷的本院2013～2014年住院患者,健康對(duì)照57例均采自市中心血站義務(wù)獻(xiàn)血者(CTL組), 外周血小板計(jì)數(shù)正常。常規(guī)方法檢測患者的白蛋白(ALB)、凝血酶原活動(dòng)度(PTA)等肝功能指標(biāo)。三組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 具有可比性。

1.2 檢測方法 ELISA方法檢測血中TPO、PAIgG水平。

1.3 試劑與儀器 PAIgG采用太陽生物技術(shù)公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒；TPO采用美國R&D systems INC公司生產(chǎn)ELISA試劑盒,嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。采用美國W.W4型酶標(biāo)洗板機(jī),奧地利-100型酶標(biāo)儀檢測。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 樣品制備 清晨空腹采取靜脈血, EDTA抗凝, 常規(guī)方法分離血漿-20℃保存, 用于檢測TPO水平；PAIgG用血按太陽生物技術(shù)公司提供的血小板制備試劑盒說明書進(jìn)行血小板分離與洗滌, 制備血小板懸液, 并用其提供的標(biāo)本儲(chǔ)存液-20℃保存待測。

1.4.2 ELISA法血漿TPO檢測 參照試劑盒操作程序進(jìn)行：即將上述血漿按一定稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品200 μl 加入酶標(biāo)反應(yīng)孔內(nèi), 置4℃, 孵育3 h。洗板3次后, 加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鼠抗人TPO單克隆抗體, 置4℃孵育30 min。洗板3次, 加入底物反應(yīng)體系, 顯色, 于全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀上直接讀數(shù), 單位為pg/ml。

1.4.3 ELISA法血小板懸液PAIgG檢測 參照試劑盒操作程序進(jìn)行：①包被：包被緩沖液將羊抗人IgG抗體稀釋成10 μg/ml, 加入40孔聚丙酰胺反應(yīng)板內(nèi), 0.1 ml/孔, 置37℃3 h后4℃過夜, 次日洗滌3次甩干。 ②加標(biāo)本：于包被反應(yīng)板前兩排加入倍比稀釋的已知量統(tǒng)一參考血清, 0.1 ml/孔,后兩排加入血小板待測標(biāo)本, 0.1 ml/孔, 置37℃溫箱90 min取出, 洗滌3次甩干。③加酶標(biāo)：將酶標(biāo)結(jié)合物稀釋成一定的濃度, 加入0.1 ml/孔, 置37℃溫箱60 min取出, 洗滌3次甩干 。④加基質(zhì)：加新鮮配置的基質(zhì)液0.1 ml/孔, 10 min后顯色, 再加入2 mol濃硫酸終止反應(yīng), 酶標(biāo)光度上比色, 讀出OD值, 單位為ng/107(Plt)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x-±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

CTL組P AIgG為(37.25±21.00)ng/107(Plt)； LC組PAIgG為(90.15±52.99)ng/107(Plt) , CHB組PAIgG為(92.71± 40.98)ng/107(Plt), CTL組明顯低于另兩組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。CTL組血漿TPO為(82.30±21.84)pg/ml, LC組為(61.56± 17.45)pg/ml, 明顯低于CTL組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；CHB組血漿TPO為(96.98±29.37)pg/ml, 與CTL組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。經(jīng)相關(guān)分析, PAIgG與外周血血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.497, P＜0.01)。

3 討論

病毒性肝炎血小板減少的機(jī)制較為復(fù)雜。近年研究發(fā)現(xiàn)慢性肝病患者血小板相關(guān)免疫球蛋白(PAIg)增高, 血小板計(jì)數(shù)與PAIgG之間呈負(fù)相關(guān), 因此認(rèn)為慢性肝病患者血小板減少可能與自身免疫紊亂有關(guān)。

PAIg包括PAIgG、PAIgA、PAIgM, 其中PAIgG占絕大多數(shù)。PAIgG可有兩種組分, 一種是真正的抗血小板抗體,或稱血小板特異性抗體；另一種為免疫復(fù)合物。真正的抗血小板抗體可被人血小板吸附, 并與血小板膜糖蛋白GP相結(jié)合, 其中IgG、IgA與GPⅡb/Ⅲa、Ⅰa/Ⅱa等結(jié)合, 而IgM與GPⅢa、GPⅠb相結(jié)合, 隨血流到脾臟、肝臟等單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)被吞噬和破壞, 從而導(dǎo)致血小板減少。有學(xué)者檢測了84例病毒性肝炎患者和20例健康對(duì)照者PAIgA、PAIgG、PAIgM水平, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：病毒性肝炎血小板減少癥組PAIgG水平顯著高于病毒性肝炎血小板正常組和健康對(duì)照組, 且與血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)；PAIgA 、PAIgM較對(duì)照組也增高, 但與血小板計(jì)數(shù)的相關(guān)性較小。本研究表明：CHB和LC組患者PAIgG水平較CTL組均明顯升高(P＜0.01), 且與外周血血小板計(jì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.497, P＜0.01), 說明免疫因素致血小板破壞為慢性乙肝血小板減少的原因之一。

總之, PAIgG參與了慢性乙肝、乙肝肝硬化伴血小板減少的發(fā)??；而肝硬化的血小板減少機(jī)制還與TPO生成減少有關(guān)。

［1］ 馬艷麗, 任萬華.病毒性肝炎血小板減少機(jī)制探討.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2005, 14(3):315-317.

［2］ 田賢江 , 王文香 , 吳敦煌 , 等.拉米夫定治療慢性乙型肝炎患者血小板變化的觀察.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2008, 17(3): 208-211.

［3］ 蔣孝華, 蔡亞平.病毒性肝炎患者血小板減少與脾臟腫大和血小板生成素的關(guān)系.南華大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2005(3):361-363.

［4］ 羅炳棋 , 向賢宏 , 陳偉 .肝硬化脾亢致血小板減少的影響因素與治療選擇 .影像診斷與介入放射學(xué), 2010, 19(6):373-376.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.31.016

2015-04-30］

110006 沈陽市第六人民醫(yī)院