謝林峰 向俊蓓 孫亞男 徐曾濤

近年來，隨著基因組技術的不斷完善以及基因組計劃的發(fā)展，人類已經(jīng)獲得了包括人類自身在內(nèi)的3173個物種的全部基因序列（Genome Online Database，http：//www.genomesonline.org），這為學者提供了巨量的遺傳信息資源，推動著生命科學向著更加個性化、精確化以及規(guī)?；姆较虬l(fā)展，為人類認識生命、治療疾病甚至改造生命奠定了基礎。然而，基因只是攜帶遺傳信息的DNA片段，由基因所表達出的蛋白質(zhì)才具有執(zhí)行生命活動的功能。因此，機體蛋白質(zhì)的結構與功能以及蛋白質(zhì)表達圖譜的探究成為近年來生命科學領域的研究熱點[1]。在1994年，Wilkins等提出蛋白質(zhì)組的概念，它是指由一個基因組（Genome）或一個細胞、組織在特定的環(huán)境或狀態(tài)下所表達的所有蛋白質(zhì)。這個新概念的提出對蛋白質(zhì)的研究具有革命性的意義。而后，隨著人們對蛋白質(zhì)組研究的不斷深入，大規(guī)模、高通量的蛋白質(zhì)分析成為必須，蛋白質(zhì)芯片技術的發(fā)明與完善恰好解決了這個問題。蛋白質(zhì)芯片技術又叫蛋白質(zhì)微陣列，它是一門微電子、微機械、化學等與生命科學結合的新興技術。其作為蛋白質(zhì)組研究工具時所表現(xiàn)出的高通量、高靈敏度、高特異性、自動化、微型化等特點，具有比傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組研究方法如二維凝膠電泳和酵母雙雜交技術等更大的優(yōu)越性[2]。如今，蛋白質(zhì)芯片技術已經(jīng)廣泛應用于食品、生物、醫(yī)學等領域的基礎性研究當中，特別是在臨床醫(yī)學中，蛋白質(zhì)芯片技術在腫瘤、傳染性疾病以及自身免疫性疾病的早期診斷以及檢測病原微生物與毒素等方面發(fā)揮著巨大的應用價值與潛能[3]。本文對蛋白質(zhì)芯片技術的原理，分類與其在臨床中的最新應用進展作一總結。

1 蛋白質(zhì)芯片的原理

蛋白質(zhì)芯片是把多種不同蛋白質(zhì)高密度的固定在固相載體（玻璃、硝酸纖維素膜、硅片、PVDF膜等）的表面而形成的蛋白質(zhì)微陣列。然后與酶、同位素或熒光素等活性物質(zhì)標記的靶蛋白質(zhì)分子進行雜交。待其結合到芯片表面介質(zhì)后，通過質(zhì)譜儀、電荷偶聯(lián)照相系統(tǒng)及CCD掃描儀等檢測芯片信號，然后用計算機分析軟件對所獲得的信號進行快速、準確的分析，最后得到大量的信息[4]。該芯片技術是在基因芯片后發(fā)展而起的后基因組研究芯片技術，彌補了基因芯片運用上的局限性。

2 蛋白質(zhì)芯片的分類

蛋白質(zhì)芯片的分類標準很多，其中以蛋白質(zhì)芯片檢測方法為標準可將其分為探針標記檢測法芯片、無探針標記檢測法芯片。熒光檢測法屬于探針標記檢測法，因其具有安全、簡易、靈敏度高等優(yōu)點成為目前應用最廣泛的檢測方法。其次為非探針標記的檢測方法。如SELDI蛋白質(zhì)芯片技術，又稱為表面增強激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜（surface- enhanced laser desorption/ionization -time of flightmass spectrometry，SELDI-TOF-MS）。它的優(yōu)點是防止蛋白質(zhì)與探針相互結合后可能導致的某些蛋白質(zhì)變性，從而提高檢測結果的準確度。整個過程方便、快捷、準確率高。在蛋白表型的研究、生物標志物的尋找、藥物研發(fā)，特別是在臨床上對腫瘤的早期診斷上發(fā)揮著重要的作用[5]。

3 蛋白質(zhì)芯片在臨床上的應用

3.1 在腫瘤診斷中的應用 目前，對腫瘤的檢測與診斷已經(jīng)具有了一系列比較成熟的檢測方法，比如生化檢查、器械檢查、免疫及遺傳學檢查等多種方法，然而對腫瘤早期的診斷以及受多種因素影響而未出現(xiàn)明顯臨床癥狀的疾病，這些方法往往表現(xiàn)出敏感性與特異性不高的缺點。另據(jù)統(tǒng)計分析表明，35%的結腸癌、50%的乳腺癌與56%的前列腺癌在轉移之前無法用以上方法檢出。可喜的是，蛋白質(zhì)芯片技術的發(fā)展正好彌補了以上技術的不足，因其能高靈敏度地尋找到新的腫瘤標記物，所以在腫瘤的早期診斷與監(jiān)測治療效果中發(fā)揮著重要的作用，成為臨床醫(yī)學領域最前沿的研究技術之一。Lu等[6]利用SELDI-TOF-MS技術對胃癌患者與非胃癌人群血清標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)五個蛋白峰（m/z分別為2046、3179、1817、1725和1929）組成的診斷模型可以作為檢測胃癌的最佳標志物。同時，單一的蛋白峰（m/z4665）的變化可以鑒別出一/二階段的胃癌與三/四階段的胃癌，其特異性達到91.6%，靈敏性達到95.4%；Wang等[7]利用蛋白芯片SELDI-TOF-MS技術對結腸癌相關成纖維細胞與正常結腸間質(zhì)成纖維細胞中的蛋白質(zhì)表達量進行分析，結果發(fā)現(xiàn)在總細胞裂解物中，有4個蛋白峰（m/z分別為1142、3011、4035和4945）被檢測到，在條件培養(yǎng)基中，兩個蛋白峰（m/z為1368、1389）被檢測到，這些蛋白質(zhì)的改變在結腸癌微環(huán)境中起著重要的作用；Xu等[8]利用蛋白芯片SELDI-TOF-MS技術檢測大腸癌患者大腸組織中蛋白質(zhì)指紋圖譜，分析結果發(fā)現(xiàn)，通過篩選不同標志物建立診斷模型，由15個蛋白峰（m/z分別為3850、3570、3651、5012、3338、6618、3904、5224、2909、5208、3645、5034、3451、8424和3628）建立的診斷組織模型診斷大腸癌組織與正常組織的敏感性與特異性均達到100%，此技術有望成為一種具有高度敏感性的檢測工具；Fan等[9]利用蛋白芯片SELDI-TOF-MS技術篩選出三個蛋白峰（m/z分別為6630、8139與8942）來構建高鑒別力的診斷模型用以診斷乳腺癌，其靈敏度與特異性分別達到96.45%與94.87%。Song等[10]建立了基于SELDI-TOF-MS技術的肺癌診斷模型，由4個蛋白峰（m/z分別為6445、9725、11 705與15 126）組成的診斷模型在鑒別肺癌患者與非肺癌者的靈敏度為93.3%（28/30），特異性為90.5%（57/63）；Liu等[11]利用蛋白芯片技術鑒別特異性胰腺癌個體與健康個體，其特異性與敏感性均為91.6%；Petricoin等[12]利用SELDI-TOF-MS技術檢測了非卵巢癌人群與卵巢癌患者的血清標本，結果發(fā)現(xiàn)其中五個蛋白質(zhì)峰（m/z分別為534、989、2111、2251、2465）同時發(fā)生變化，與傳統(tǒng)的卵巢癌標志物CA125相比，由它們組成的蛋白質(zhì)指紋圖譜檢測早期卵巢癌的陽性預測值提高到94%，特異性為95%，敏度達到100%。因此，在卵巢癌的早期診斷中發(fā)揮著非常重要的意義。

3.2 在傳染性疾病研究中的應用 現(xiàn)如今，對傳染性疾病的檢測已經(jīng)有一套成熟的體系與檢測方法，并取得了良好的效果。同時，蛋白質(zhì)芯片技術作為一種新開發(fā)出的優(yōu)越的蛋白質(zhì)分析技術，其在檢測傳染病病原體、研究其毒力、致病與耐藥機制等方面發(fā)揮著重要的作用。例如感染HIV的患者，聯(lián)合感染HBV或HCV的情況較為常見，傳統(tǒng)的檢測方法操作步驟較繁瑣，敏感度較低。Xu等[13]開發(fā)出了一種蛋白質(zhì)芯片，它能夠同時檢測感染者血清中的HBV、HCV、HDV、HEV與HGV的相應的抗體，大大減少了血清樣品的用量，提高了檢測敏感性。Quiel等[14]利用電蛋白質(zhì)芯片技術快速鑒定金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌的致病因子，此方法比傳統(tǒng)的SDS-PAG和Western immunoblotting檢測方法更快速、更安全，靈敏度也更高。同時，Zhu等[15]開發(fā)出一種Epstein-Barr病毒（EBV）蛋白芯片鑒定EBV蛋白激酶BGLF4的底物，并證明BGLF4對EBV裂解周期的影響不僅通過EBV裂解DNA的磷酸化復制于病毒蛋白，同時受BGLF4的底物EBNA1的復制功能的干擾，使EBNA1成為潛在的治療靶向。蘇乃倫等[16]運用SELDI蛋白質(zhì)芯片技術檢測Vero細胞感染HSV-1后蛋白質(zhì)的差異表達，結果發(fā)現(xiàn)19個蛋白表達差異峰，方法簡便，敏感性高。田淑梅等[17]利用蛋白質(zhì)芯片技術檢測100例幽門螺桿菌抗體，結果表明CagA陽性為55%，VacA陽性為29%，Ure陽性為16%，與ELISA與免疫印跡法相比，其檢測更快速高效，靈敏度更高。

3.3 自身免疫性疾病上的應用 自身免疫性疾?。ˋutoimmune disease，AID）的發(fā)病原理與診斷程序相當復雜，蛋白質(zhì)芯片技術已成為檢測自身免疫性疾病的有力工具。如今，對自身免疫性疾病的診斷主要靠相關的臨床表現(xiàn)以及患者血清中相應抗體的檢測。臨床上傳統(tǒng)的自身抗體檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法、免疫斑點、免疫沉淀、免疫印跡法等[18]。然而這些方法分別存在著相應的不足之處。比如間接免疫熒光法，雖然其靈敏度高，檢測范圍廣，但是其操作相對復雜，需要昂貴的儀器設備，很難推廣到基層醫(yī)院，又如酶聯(lián)免疫吸附法，雖然操作相對簡單，不需要特別的熒光儀器，但其假陽性產(chǎn)生較多。所以這些傳統(tǒng)方法在一定程度上無法滿足人們對自身免疫性疾病的檢測需求[19]。慶幸的是蛋白質(zhì)芯片技術的開發(fā)與使用為自身免疫性疾病的診斷與治療提供了更優(yōu)越的方法。例如Long等[20]利用蛋白質(zhì)芯片檢測風濕病患者，其靈敏度達到87.5%，特異性達到96.7%，且與晚期風濕病組（病程>12個月）和健康組相比，蛋白峰（m/z分別為1014與1061）在早期風濕病組（病程<12個月）有顯著上升，其結果比傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法有更高的靈敏度。Wright等[21]利用蛋白質(zhì)芯片對強直性脊柱炎患者的多種自身抗體進行檢測，取得良好效果。王國強等[22]開發(fā)出一種能同步檢測12種常見自身抗體的蛋白質(zhì)芯片診斷系統(tǒng)，臨床研究表明此系統(tǒng)對這12種抗體的檢測達到80%~96.3%的敏感度以及86.7%~100%的特異性，符合率高。

4 蛋白質(zhì)芯片技術的不足與展望

蛋白質(zhì)芯片技術的開發(fā)在后基因組時代蛋白質(zhì)組學的研究上具有巨大的應用價值，并且已經(jīng)在生命科學、醫(yī)學等諸多領域得到廣泛的應有，且取得了大量的成果，展現(xiàn)出在蛋白質(zhì)研究方面無可比擬的優(yōu)勢。然而，相對于更完善的基因芯片技術，蛋白質(zhì)芯片技術相對滯后，表現(xiàn)在芯片的制作與應用及診斷結果的可靠性上還存在著大量需要改進的地方。首先，現(xiàn)在蛋白質(zhì)的表達和純化方法無法滿足蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)的需求。同時，制作蛋白質(zhì)芯片時須已知每個蛋白的性質(zhì)，且必須用可溶性性蛋白，這樣就限制了蛋白芯片的應用范圍。第二，目前蛋白質(zhì)結合到固定載體上的特異性還不夠強，因此需要尋找更優(yōu)化的材料表面的修飾方法，以使蛋白質(zhì)更加特異的結合在載體上。第三，現(xiàn)在的蛋白質(zhì)芯片技術仍需增強芯片結合更多蛋白質(zhì)種類與數(shù)目的能力，收集更豐富的信息。第四，蛋白質(zhì)芯片制作程序復雜，蛋白質(zhì)容易變性，加之昂貴的檢測設備與試劑阻礙了芯片的大規(guī)模使用。因此研制出快速、簡潔、低價的制備與檢測方法，在降低其成本的同時，進一步提高芯片檢測的靈敏度，將成為往后蛋白質(zhì)芯片開發(fā)的難點與重點。在可以預見的未來，隨著蛋白質(zhì)芯片技術的不斷完善，其自動化、微型化、高靈敏度、高通量、高特異性等優(yōu)勢將進一步得到體現(xiàn)，并在生命科學研究的各個領域發(fā)揮出越來越舉足輕重的作用，也必將在各種疾病的診斷與防治中展現(xiàn)出巨大的應用潛力。

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