李亮亮

(南京市第二醫(yī)院骨科,江蘇 南京　210003)

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兔慢性骨髓炎模型的建立及效果評價

李亮亮

(南京市第二醫(yī)院骨科,江蘇 南京210003)

摘要：目的 探討慢性骨髓炎動物模型的制備。方法 40只新西蘭大白兔采用脛骨近端髓腔內(nèi)注入金黃色葡萄球菌及魚甘油酸鈉，4周后觀察局部皮膚軟組織情況、X線表現(xiàn)、細菌學檢查及組織學檢查。結(jié)果 所有兔均出現(xiàn)局部軟組織腫脹、竇道，34只兔出現(xiàn)明顯的放射學改變，如骨膜反應，骨皮質(zhì)溶解等，36只兔髓腔組織培養(yǎng)出現(xiàn)金黃色葡萄球菌菌落生長，病理檢查可見死骨形成及大量炎性細胞浸潤。結(jié)論 兔脛骨近端髓腔注入金黃色葡萄球菌及魚肝油酸鈉制備慢性骨髓炎模型，方法簡單、效果可靠，值得推廣。

關鍵詞：兔；慢性骨髓炎；金黃色葡萄球菌

隨著交通創(chuàng)傷的頻繁發(fā)生，開放性骨折合并骨髓炎的發(fā)生率也在日益增高。雖然臨床上有較多的治療辦法，但是慢性骨髓炎的治愈至今仍是一個無法完全解決的難題，造成患者嚴重的肢體功能障礙及經(jīng)濟負擔[1]。制作滿意的動物慢性骨髓炎實驗模型，對于慢性骨髓炎的發(fā)病機制、病理變化以及臨床治療都有著深刻的意義。本實驗的目的是通過采用新西蘭大白兔建立慢性骨髓炎模型。

1材料與方法

1.1材料新西蘭大白兔40只(南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院動物實驗中心提供，體質(zhì)量2.5 kg左右，雌雄不限，單獨飼養(yǎng)，標準進食)，金黃色葡萄球菌ATCC29213(南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院檢驗科提供)，5%魚肝油酸鈉注射液(上海東海制藥廠，每支2 mL:0.1 g，產(chǎn)品批號：滬衛(wèi)藥準字090606)。

1.2方法

1.2.1細菌培養(yǎng)將金黃色葡萄球菌ATCC29213劃線接種于血瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出，無菌接種環(huán)挑取適量菌落融入營養(yǎng)肉湯中，繼續(xù)于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出后適量無菌生理鹽水稀釋，調(diào)整菌液濃度為每毫升1×108cfu，菌液配制完成后立即使用。

1.2.2動物實驗過程兔稱重后肌注安定(1 mg·kg-1)，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉(30 mg·kg-1)，麻醉成功后脛骨近端處剪毛，四肢固定于手術臺上，常規(guī)消毒鋪巾，取脛骨近端外側(cè)縱行切口，逐層分離，暴露脛骨平臺，2 mm克氏針鉆孔，打通骨髓腔，向骨髓腔內(nèi)依次注入5%魚肝油酸鈉0.1 mL、1×108cfu·mL-1的金葡菌液0.1 mL，骨蠟封閉鉆孔，無菌生理鹽水沖洗傷口，逐層縫合。術后不予應用抗生素，肢體不制動，單獨飼養(yǎng)，標準進食，4周后處死。

1.2.3觀察指標大體觀察：術后觀察切口愈合情況，有無紅腫，流膿，竇道形成，局部體毛生長情況；放射學檢查：術后4周行X線檢查；細菌學檢查：取兔脛骨骨髓腔內(nèi)容物涂抹在血瓊脂平板上置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h；組織學觀察：兔處死后截取左脛骨中段橫斷面，4%甲醛溶液固定，脫鈣，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察。

2結(jié)果

造模過程中因麻醉致死1只，術后2周內(nèi)因腹瀉致死3只，剩余36只全部計入觀察范圍。

2.1大體觀察術后1周有19只兔局部出現(xiàn)紅腫，2周后所有兔出現(xiàn)切口處紅腫滲液，局部膿腫形成，體毛無明顯增長。3周時兔局部紅腫明顯，膿腫竇道形成，局部體溫增高，跛行。4周處死前所有兔局部情況較前好轉(zhuǎn)，但仍有膿腫、竇道、滲液，局部皮膚顏色發(fā)紅，體毛無增長,見圖1。

2.2放射學檢查34只兔有明顯的放射學改變，包括：骨小梁結(jié)構(gòu)的吸收，骨膜反應，骨皮質(zhì)溶解，局部新骨形成以及軟組織陰影(圖2)。余2只兔放射學改變不是十分明顯，僅有局部軟組織陰影，輕微骨膜反應。

2.3細菌學檢查以細菌培養(yǎng)陽性作為是否有骨髓腔感染的指標。36只兔全部培養(yǎng)出現(xiàn)金黃色葡萄球菌菌落生長，見圖3。

2.4組織學改變?nèi)?6只兔脛骨周圍軟組織可見多處較小膿腔形成；30只兔出現(xiàn)嚴重骨質(zhì)破壞，膿液穿透骨質(zhì)，進入膝關節(jié)腔。沿矢狀面剖開脛骨，見原有鮮紅色骨髓組織消失，髓腔內(nèi)黃白色膿液形成，見圖4。HE染色可見死骨形成及大量炎性細胞浸潤，見圖5。

3討論

動物模型是醫(yī)學研究中建立的以動物模擬人類疾病的實驗對象和材料，對于醫(yī)學的發(fā)展起著至關重要的作用。滿意的動物模型的建立對于某一疾病的研究、治療、預后都有著深刻的意義。骨髓炎是由于致病菌引起的骨與骨相關組織的急、慢性炎癥反應，好發(fā)于下肢脛骨[2]，需要長期應用抗生素治療及必要的外科手術清創(chuàng)[3]。隨著細菌耐藥性的增加，抗生素可選性減小，臨床醫(yī)師在治療骨髓炎上有時顯得捉襟見肘，多種新型的抗菌藥物及其他治療方法已在研究及初步應用中，因此，簡單而高效的動物骨髓炎模型的制作對于研究抗菌藥物治療效果及預后顯得尤為重要。

關于制作慢性骨髓炎動物模型的報道最早見于1884年， 但是直到1941年，Maley等[4]應用葡萄球菌及魚肝油酸鈉注入兔脛骨近端成功制作兔慢性骨髓炎模型，為后來的研究奠定了基礎及標桿，以后的制模方法多在此基礎上進行改良和升級。目前動物實驗研究通常選用鼠、犬、兔、羊等，兔因其體積小，價格低，性情溫順，易于飼養(yǎng)等優(yōu)點，被廣泛應用于動物模型的制作。 兔脛骨部位軟組織覆蓋少，暴露操作容易，因此是最常用的制模部位[5]，其他制模部位還有下頜骨、股骨等[6-7]。目前主要做法是脛骨鉆孔后直接注入細菌，也有學者采用注射細菌的同時植入外源性異物以增加感染的幾率，并取得了較好的效果[8-10]。為了模擬臨床中常見的創(chuàng)傷性骨髓炎病例，也有學者制作兔脛骨開放性骨折繼發(fā)骨髓炎模型[11]。本文中，我們采用直接注射細菌的方法，操作簡單，效果可靠。金黃色葡萄球菌是臨床上導致慢性骨髓炎最主要的致病菌[12]，因此，我們采用金黃色葡萄球菌作為此次實驗的菌種。 關于制模過程中需要植入的細菌的數(shù)量，各家說法不一，多數(shù)學者認為細菌數(shù)量應在1×106～1×108cfu之間[13]，細菌數(shù)量過高可能會導致動物的死亡，過低不能達到滿意的制模效果。國內(nèi)唐輝等[14]認為，至少需要植入6×105cfu金黃色葡萄球菌，才會出現(xiàn)明顯的骨感染征象及細菌學結(jié)果，我們認為，這與動物個體免疫力差異和細菌菌株毒力差異有關。本實驗中，我們采用1×108cfu這個數(shù)量級，取得了滿意的效果。

動物模型在醫(yī)藥學領域的貢獻是有目共睹的，任何一種新藥的誕生和臨床新技術的應用都離不開良好的動物模型。考察一種制模方法優(yōu)良與否，不僅要關注它的成功率，也要追求方法的簡單性和可操作性。只有簡單易得，那么此種方法才能廣泛推廣。通過國內(nèi)外骨科前輩的研究及自身體會，我們認為，兔脛骨鉆孔后髓腔內(nèi)注射金黃色葡萄球菌及魚肝油酸鈉制作慢性骨髓炎模型，操作簡單，效果可靠，適用于大宗樣本的制作，值得推廣。

參考文獻：

[1]Gaudin A,Amador DVG,Hamel A,et al.A new experimental model of acute osteomyelitis due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in rabbit[J].Lett Appl Microbiol,2011,52(3):253-257.

[2] Stanley CM,Rutherford GW,Morshed S,et al.Estimating the healthcare burden of osteomyelitis in Uganda[J].Trans R Soc Trop Med Hyg，2010，104(2):139-142.

[3]Patel M,Rojavin Y,Jamali AA,et al.Animal models for the study of osteomyelitis[J].Semin Plast Surg，2009,23(2):148-154.

[4]Maley JR,Mertens WD,Bahr A.Osteomyelitis-related sequestrum formation in association with the combination tibial plateau levelling osteotomy and cranial closing wedge osteotomy procedure[J].Vet Comp Orthop Traumatol，2010，23(2):141-147.

[5]Moskowitz JS,Blaisse MR,Samuel RE,et al.The effectiveness of the controlled release of gentamicin from polyelectrolyte multilayers in the treatment of Staphylococcus aureus infection in a rabbit bone model[J].Biomaterials，2010，31(23)：6019-6030.

[6]張小磊,沈菊香,謝志堅.兔下頜骨慢性化膿性骨髓炎動物模型的建立[J].中國實驗動物學報,2012,20(3):74-77.

[7]吳偉,李振清,楊建中,等.可降解抗生素緩釋載體治療慢性骨髓炎動物模型的實驗研究[J].實用骨科雜志,2013,19(3):229-231.

[8]Borzsei L,Mintal T,Koos Z,et al.Examination of a novel,specified local antibiotic therapy through polymethylmethacrylate capsules in a rabbit osteomyelitis model[J].Chemotherapy,2006,52(2):73-79.

[9]章相鋒,阮峰,譚彥斌.明膠海綿吸附金黃色葡萄球菌改進兔慢性骨髓炎模型[J].中華實驗外科雜志,2012,29(6)：1204.

[10] Robinson DA,Bechtold JE,Carlson CS,et al.Development of a fracture osteomyelitis model in the rat femur[J].J Orthop Res,2011,29(1)：131-137.

[11] 褚立濤,郭國棟,劉剛,等.兔脛骨創(chuàng)傷后骨髓炎動物模型的建立[J].醫(yī)學研究生學報,2012,25(11)：1160-1162.

[12] Howell WR,Goulston C.Osteomyelitis:an update for hospitalists[J].Hosp Pract,2011,39(1)：153-160.

[13] 聞一新，周田華，徐永清,等.兔脛骨金黃色葡萄球菌慢性骨髓炎模型的制備[J].實用骨科雜志,2013,19(11):1001-1003.

[14] 唐輝,徐永清,鄭天娥,等.耐藥金黃色葡萄球菌注射總量對兔感染性骨缺損形成的影響[J].中國矯形外科雜志,2009,17(9)：700-702.

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.12.014

(收稿日期：2015-07-17，修回日期：2015-08-05)

Preparation and evaluation of rabbit model of chronic osteomyelitis

LI Liang-liang

(DepartmentofOrthopedics,TheSecondHospitalofNanjing,Nanjing,Jiangsu210003,China)

Abstract:Objective To prepare and evaluate animal model of chronic osteomyelitis. Methods Forty New Zealand white rabbits were involved in the experiment and the bacterial suspension of the Staphylococcus aureus and sodium morrhuate were injected into the proximal tibial marrow cavity of the rabbits. Evaluation was done by clinical, radiologic, bacteriologic and histologic parameters after four weeks. Results All of the rabbits had local soft tissue lump and sinus. Thirty-four rabbits showed obvious radiological evidence, such as periosteal reaction and dissolution of cortical bone. The culture of myeloid tissue showed the growth of Staphylococcus aureus in thirty-six rabbits, the histologic observation of which indicated the development of sequestra and large amount of inflammatory cells. Conclusions The chronic osteomyelitis of rabbit can be induced by injecting Staphylococcus aureus and sodium morrhuate into the proximal tibial marrow cavity. This method is simple and reliable, which is worthy of promotion.

Key words:rabbit;chronic osteomyelitis;staphylococcus aureus