梁羽，李燦，羅蘭，楊拯，王強(qiáng)，馬俊，王洋洋，張璐璐，楊維，易芳

脊髓損傷后早期小鼠腸道功能的變化①

梁羽，李燦，羅蘭，楊拯，王強(qiáng)，馬俊，王洋洋，張璐璐，楊維，易芳

目的 探討脊髓損傷后短期內(nèi)小鼠腸道功能的變化。方法將105只昆明種小鼠隨機(jī)分為正常組(A組，n=30)、假手術(shù)組(B組，n=30)和模型組(C組，n=45)。A組不作處理，B組僅暴露脊髓，不夾持。C組采用動(dòng)脈瘤夾夾持T10處脊髓，復(fù)制脊髓損傷模型。分別于術(shù)后12 h、24 h、48 h測(cè)定小鼠回腸肌電慢波及平滑肌收縮力，并做回腸HE染色。結(jié)果脊髓損傷后12 h、24 h、48 h，C組小鼠肌電頻率和振幅低于A組和B組(P<0.05)，收縮力振幅低于A組和B組(P<0.05)，但24 h、48 h后收縮力頻率高于A組和B組(P<0.05)。C組各時(shí)間點(diǎn)腸黏膜評(píng)分均較A組和B組高(P<0.05)。結(jié)論小鼠脊髓損傷后早期，腸道平滑肌肌電活動(dòng)減弱，收縮力減小，腸黏膜輕度損傷。

脊髓損傷；腸道；功能障礙；小鼠

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是目前臨床上常見的中樞系統(tǒng)損傷疾病，可導(dǎo)致患者運(yùn)動(dòng)功能喪失，神經(jīng)調(diào)節(jié)紊亂。脊髓損傷后的并發(fā)癥，腸道功能障礙更是對(duì)患者造成嚴(yán)重影響。脊髓損傷患者常出現(xiàn)自主神經(jīng)反射異常，腸道順應(yīng)性降低[1-2]。探究脊髓損傷后腸道功能障礙的作用機(jī)理，可為脊髓損傷患者的用藥提供指導(dǎo)。然而，目前在這方面的探討尚顯不足，且大多著眼于損傷長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的腸道功能變化及菌群移位變化[3-6]，對(duì)脊髓損傷后短期腸道功能變化的探討較少。本文就脊髓損傷后早期小鼠腸道功能的變化進(jìn)行研究，為脊髓損傷后腸道功能障礙的機(jī)制探討提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成熟的昆明種小鼠105只，體質(zhì)量24~26 g，購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK(川)2008-24。造模前12 h，禁食但讓其自由飲水。按隨機(jī)數(shù)字表，將105只小鼠單純隨機(jī)分為正常組(A組，n=30)、假手術(shù)組(B組，n=30)和模型組(C組，n=45)。各組又分12 h、24 h、48 h 3個(gè)亞組，A組、B組每個(gè)亞組各10只，C組每個(gè)亞組各15只。

1.2 主要試劑和儀器

氯化鈉注射液：貴州科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)B121003U。5%葡萄糖注射液：安徽雙鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)100829 6K。注射用青霉素鈉：中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司，批號(hào)016130114。水合氯醛(chloral hydrate)：成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)20100920。TC-120智能程控生物組織自動(dòng)脫水機(jī)：泰維科技。KD-BM生物組織包埋機(jī)：浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司。BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：成都泰盟科技有限公司。自制動(dòng)脈夾。

1.3 模型制備

A組小鼠不予任何處理；B組和C組小鼠在用10%水合氯醛0.004 ml/g麻醉完全后，呈俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)，背部備皮，常規(guī)消毒鋪巾，依次剝開背部皮膚、筋膜，去除T10段肌肉、棘突、椎板，暴露脊髓。B組小鼠不予夾持，而C組用改良自制動(dòng)脈瘤夾(標(biāo)定力量為20 g)橫行壓迫T10處脊髓，夾至脊髓直徑的1/2，時(shí)長(zhǎng)為30 s[7]。見小鼠后腿蹬腿、擺尾以及夾持處脊髓充血?jiǎng)t示造模成功?？p合后，注射等量5%葡萄糖、氯化鈉注射液及8×104U青霉素鈉。

1.4 腸道平滑肌肌電測(cè)定

分別于術(shù)后12 h、24 h、48 h，取A組、B組各10只小鼠，C組15只小鼠，在麻醉后，將其呈仰臥位固定，常規(guī)消毒鋪巾，打開腹腔，在回盲部以上2 cm腸管肌層插入電極，連接BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，約10 min后開始記錄肌電，參數(shù)選擇：掃描速度1.00 s/div，電增益2 mV，時(shí)間常數(shù)3 s，高頻濾波5 Hz，連續(xù)記錄30 min。

1.5 腸道平滑肌收縮力測(cè)定

在各測(cè)試時(shí)間點(diǎn)，取A組、B組小鼠各10只，C組15只，將其麻醉后，打開腹腔，剪取距回盲部以上2 cm處回腸，將其固定于恒溫平滑肌槽內(nèi)37℃的臺(tái)式液中，連接BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，給予標(biāo)本1.0 g基礎(chǔ)負(fù)荷。約10 min后開始記錄肌電，參數(shù)選擇：掃描速度1.00 s/div，電增益2 mV，時(shí)間常數(shù)3 s，高頻濾波10 Hz，連續(xù)記錄30 min。

1.6 腸組織HE染色

在各測(cè)試時(shí)間點(diǎn)，取A組、B組小鼠各10只，C組15只，將小鼠麻醉完全后，打開腸腔，取回盲部以上2 cm處腸管，將其固定、脫水、包埋、HE染色，觀察各組小鼠腸黏膜變化，并用Haglund腸黏膜評(píng)分表[8]評(píng)分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間均數(shù)對(duì)比采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，使用Levene方法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，采用Student-Newman-Keuls法(S-N-K)進(jìn)行組間比較。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

A組和B組小鼠正常飲食，精神狀況良好；C組小鼠精神倦怠，后肢完全癱瘓、反應(yīng)遲鈍、飲食量少。A組和B組小鼠無(wú)死亡，C組小鼠死亡5只，剖腹檢查，3只小鼠腸脹氣、色黃，甚至穿孔。

2.2 腸平滑肌肌電的變化

C組脊髓損傷后12 h回腸肌電頻率和振幅明顯低于A組(P<0.01)，并較B組降低(P<0.05)，呈較規(guī)則的正弦波樣曲線(見圖1中A1~C1)。C組脊髓損傷后24 h肌電頻率和振幅也較A組和B組降低(P<0.05)(見圖1中A2~C2)。脊髓損傷后48 h，C組肌電圖出現(xiàn)少數(shù)切跡的非正弦波樣曲線(見圖1中A3~C3)，頻率和振幅均較A組和B組減小(P<0.05)。見表1。

2.3 腸平滑肌收縮力的變化

脊髓損傷后12 h，C組回腸平滑肌收縮頻率較A組和B組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但振幅較A組和B組減少(P<0.05)，圖像呈較規(guī)則的似正弦波形(見圖2中A1~C1)。脊髓損傷后24 h，C組回腸平滑肌收縮力頻率較A組增加(P<0.05)，振幅較A組和B組降低(P<0.05)(見圖2中A2~C2)。脊髓損傷后48 h，C組平滑肌收縮頻率較A組和B組升高(P<0.05)，振幅較A組和B組明顯減少(P<0.01)，表現(xiàn)為有大量切跡的似正弦波樣曲線(見圖2中A3~C3)。見表2。

2.4 HE染色

對(duì)各組行HE染色，觀察到各時(shí)間點(diǎn)，A組小鼠腸黏膜均無(wú)任何病理學(xué)改變(見圖3)。B組小鼠腸黏膜有少量充血，但黏膜結(jié)構(gòu)完整(見圖3)。C組12 h亞組小鼠腸黏膜下層毛細(xì)血管充血，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；24 h亞組小鼠絨毛少量脫落，黏膜下層毛細(xì)血管充血明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較多；48 h亞組小鼠腸絨毛有部分脫落，杯狀細(xì)胞明顯增生，黏膜下層有明顯出血，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較多，肌層之間部分分離(見圖3)。Haglund腸黏膜損傷評(píng)分顯示，C組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)損傷評(píng)分值均高于A組和B組(P<0.05)。見表3。

3 討論

腸道功能障礙是臨床上脊髓損傷后的常見并發(fā)癥，患者常表現(xiàn)為便秘、結(jié)腸慢輸、對(duì)非傷害性刺激低敏和自主神經(jīng)紊亂[9-10]。治療效果往往不佳，該類患者也是結(jié)直腸癌的高發(fā)人群[11]。眾所周知，腸道功能主要由交感神經(jīng)系統(tǒng)、副交感神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)等組成的神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。人體生命活動(dòng)正常時(shí)，來(lái)自脊髓的交感神經(jīng)通過進(jìn)入腸壁的交感神經(jīng)后纖維和節(jié)前纖維，與部分腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形成突觸聯(lián)系，傳遞中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息。脊髓損傷后，該系統(tǒng)傳導(dǎo)中斷，雖腸神經(jīng)系統(tǒng)可自主調(diào)控腸道運(yùn)動(dòng)，但因交感神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)的缺失，腸道活動(dòng)可出現(xiàn)調(diào)節(jié)紊亂[12]，使腸道內(nèi)容物滯留，大大增加了腸腔內(nèi)細(xì)菌量和細(xì)菌移位的發(fā)生概率。據(jù)報(bào)道，在脊髓損傷早期可出現(xiàn)腸道菌群移位和血清中的超氧化物歧化酶降低和丙二醛升高[6,13-14]，導(dǎo)致一系列神經(jīng)源性腸道功能障礙。

腸肌電是一項(xiàng)反應(yīng)腸道功能的電生理指標(biāo)，可分為慢波電位和動(dòng)作電位兩種[15]。研究發(fā)現(xiàn)，不完全性腸梗阻小鼠腸道慢波頻率減小、振幅降低[16]，慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸慢波雙向改變，部分大鼠慢波頻率減慢、振幅增加；而另一部分大鼠慢波與其相反[17]，提示慢波與腸道運(yùn)動(dòng)功能障礙密切相關(guān)。動(dòng)作電位產(chǎn)生于慢波之上，但因其易受肽類物質(zhì)、腸神經(jīng)系統(tǒng)等多種因素的影響，所以我們只對(duì)肌電慢波活動(dòng)進(jìn)行測(cè)定[18]。結(jié)果顯示，小鼠脊髓損傷后早期腸肌電節(jié)律紊亂，頻率和振幅均明顯低于正常組和假手術(shù)組，呈低頻的類正弦波樣曲線，有部分切跡。且時(shí)間點(diǎn)之間有明顯差異，隨病程發(fā)展，頻率和振幅減小愈明顯。提示脊髓損傷后早期，腸肌電活動(dòng)可出現(xiàn)異常。

腸平滑肌收縮運(yùn)動(dòng)在一定條件下也能客觀反映腸道功能。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腸缺血再灌注大鼠環(huán)形肌和縱形肌收縮力可分別受到不同程度的抑制，表現(xiàn)出收縮頻率減慢和振幅降低[19]。而Uray等發(fā)現(xiàn)腸道高度水腫的大鼠，肌球蛋白輕鏈磷酸化水平降低，腸肌收縮力的下降[20]。本研究顯示，脊髓損傷早期，回腸平滑肌收縮力頻率呈雙向改變，提示腸道便秘的初步形成，這與孫彥輝等[17]在慢傳輸型便秘大鼠上的研究結(jié)果一致，但收縮頻率總體表現(xiàn)為升高，這可能與脊髓損傷早期小鼠腸道代償性加快收縮有關(guān)，而收縮振幅卻均較正常組和假手術(shù)組低。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后小鼠收縮力頻率發(fā)展呈增高趨勢(shì)，提示脊髓損傷后腸道功能障礙可能與腸道平滑肌的異常收縮有關(guān)，并可在損傷早期表現(xiàn)。

而HE染色發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后早期小鼠腸黏膜已出現(xiàn)損傷，絨毛脫落明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞增多，毛細(xì)血管充血甚至出血，肌層之間出現(xiàn)分離，各時(shí)間點(diǎn)腸黏膜評(píng)分均較正常組和假手術(shù)高。病理?yè)p傷程度呈漸進(jìn)性發(fā)展，脊髓損傷后24 h和48 h小鼠腸黏膜損傷程度明顯高于12 h時(shí)間點(diǎn)小鼠。損傷程度總體表現(xiàn)較輕，提示脊髓損傷早期可出現(xiàn)腸道黏膜損傷，但病變程度較輕。

綜上所述，脊髓損傷后早期小鼠可表現(xiàn)出腸道肌電慢波活動(dòng)的減少，收縮力的高頻降低，并隨病程發(fā)展，其異常愈加明顯，并出現(xiàn)鏡下可見的腸道黏膜損傷。表明肌電慢波和腸肌收縮力異常可能是脊髓損傷后腸道功能障礙的機(jī)制之一。本研究尚未對(duì)其他生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，因此還需其他學(xué)者對(duì)脊髓損傷后腸道功能障礙的作用機(jī)制進(jìn)行更加全面和深入的探討。

[1]Preziosi G,Raptis DA,Raeburn A,et al.Autonomic rectal dysfunction in patients with multiple sclerosis and bowel symptoms is secondary to spinal cord disease[J].Dis Colon Rectum,2014,57(4):514-521.

[2]逯曉蕾,李建軍,杜良杰,等.脊髓損傷后腸道功能的變化[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2010,16(8):758-760.

[3]Bai C,An H,Wang S,et al.Treatment and prevention of bacterial translocation and endotoxemia with stimulation of the sacral nerve root in a rabbit model of spinal cord injury[J].Spine(Phila Pa 1976),2011,36(5):363-371.

[4]劉建偉,安洪,蔣電明,等.大鼠脊髓損傷致截癱后腸道細(xì)菌移位的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)脊柱脊髓雜志,2003,13(9):547-550.

[5]龍志華,徐青,王磊,等.脊髓損傷后大鼠結(jié)腸血管活性腸肽能神經(jīng)元表達(dá)的變化[J].中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2012,7(2):103-106,119.

[6]楊進(jìn)順,呂浩然,廖壯文,等.大鼠急性脊髓損傷動(dòng)物模型的建立及影像學(xué)分析[J].廣東醫(yī)學(xué),2011,32(5):559-561.

[7]Fynne L,Wors?e J,Gregersen T,et al.Gastric and small intestinal dysfunction in spinal cord injury patients[J].Acta Neurol Scand,2012,125(2):123-128.

[8]Haglund U,Osterberg J.Local consequences of reperfusion in the gut[M]//Pierce A,Mathie RT.Ischemia-Reperfusion Injury.Oxford UK:Blackwell Science,1999:65-69.

[9]Awad RA,Santillán MC,Camacho S,et al.Rectal hyposensitivity for non-noxious stimuli,postprandial hypersensitivity and its correlation with symptoms in complete spinal cord injury with neurogenic bowel dysfunction[J].Spinal Cord,2013,51(2):94-98.

[10]Zhang Y,Guan Z,Reader B,et al.Autonomic dysreflexia causes chronic immune suppression after spinal cord injury[J].J Neurosci,2013,33(32):12970-12981.

[11]Hayman AV,Guihan M,Fisher MJ,et al.Colonoscopy is high yield in spinal cord injury[J].J Spinal Cord Med,2013,36(5):436-442.

[12]Alexander MS,Biering-Sorensen F,Bodner D,et al.International standards to document remaining autonomic function after spinal cord injury[J].Spinal Cord,2009,47(1):36-43.

[13]謝少華,楊拯,龔都,等.原花青素對(duì)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18(9):831-833.

[14]李曉,羅晨禹,楊拯,等.番茄紅素抗氧化應(yīng)激效應(yīng)對(duì)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2013,19(2):132-135.

[15]Seidl H,Gundling F,Pehl C,et al.Multiple intraluminal impedance measurement and manometry in the jejunum of healthy subjects:a new tool for diagnosis of small bowel motility[J].Digestion,2010,81(3):172-180.

[16]Chang IY,Glasgow NJ,Takayama I,et al.Loss of interstitial cells of Cajal and development of electrical dysfunction in murine small bowel obstruction[J].J Physiol,2001,536(Pt 2):555-568.

[17]孫彥輝,孫永輝,肖紅玲,等.溫針灸對(duì)慢傳輸型便秘大鼠結(jié)腸肌電的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2012,23(5):1176-1177.

[18]Seidl H,Gundling F,Pehl C,et al.Multiple intraluminal impedance measurement and manometry in the jejunum of healthy subjects:a new tool for diagnosis of small bowel motility[J].Digestion,2010,81(3):172-180.

[19]Murata P,Kase Y,Tokita Y,et al.Intestinal ischemia/reperfusion injury aggravates talc-induced adhesions in rats[J].J Surg Res,2006,135(1):45-51.

[20]Uray KS,Laine GA,Xue H,et al.Intestinal edema decreases intestinal contractile activity via decreased myosin light chain phosphorylation[J].Crit Care Med,2006,34(10):2630-2637.

Intestinal Function Changes in Mice after Spinal Cord Injury in Early Stage

LIANG Yu,LI Can,LUO Lan,YANG Zheng,WANG Qiang,MA Jun,WANG Yang-yang,ZHANG Lu-lu,YANG Wei,YI Fang.Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China

ObjectiveTo investigate the influence of spinal cord injury on intestinal function in mice after a short period.Methods105 Kunming mice were randomly assigned to normal group(group A,n=30),sham group(group B,n=30)and model group(group C,n=45).Group A

no treatment,group B was only exposed the spinal cord,while group C was induced by a constant compression with a modified arterial forcep at T10to establish spinal cord injury model.12 hours,24 hours and 48 hours after modeling,myoelectric slow wave activity and tension activity of the ileum were tested,and HE staining was used.ResultsCompared with groups A and B,the slow wave activity was significantly weaker in group C at every time point(P<0.05),so was the amplitude of tension activity(P<0.05).Frequency of tension activity was obviously higher in group C than in groups A and B 24 hours and 48 hours after modeling(P<0.05).The injury scores were higher in group C than in groups A and B(P<0.05).ConclusionThere is reduce in myoelectric slow wave activity,tension activity of the ileum and mild injury in intestinal mucosa in mice after spinal cord injury in the early stage.

spinal cord injury;intestine;dysfunction;mice

CITED AS:Liang Y,Li C,Luo L,et al.Intestinal function changes in mice after spinal cord injury in early stage[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(2):148-152.

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.02.006

1.國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(No.201313705002)；2.成都醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(No.CXXS201307)。

成都醫(yī)學(xué)院，四川成都市610500。作者簡(jiǎn)介：梁羽(1993-)，女，四川綿竹市人，麻醉學(xué)本科生。通訊作者：楊拯(1980-)，男，漢族，四川蒼溪縣人，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事胃腸道動(dòng)力障礙疾病和脊髓損傷的機(jī)制與治療研究。E-mail:yzixjj@163.com。

R651.2

A

1006-9771(2015)02-0148-05

[本文著錄格式]梁羽，李燦，羅蘭，等.脊髓損傷后早期小鼠腸道功能的變化[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,21(2):148-152.

2014-05-19

2014-06-09)

·臨床研究·