李 清，劉小莉，王 英，董明盛，周劍忠,*

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

益生菌是指能以一定數(shù)量存活并定殖于宿主腸道內(nèi)，通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群平衡對(duì)宿主健康發(fā)揮有益作用的單一或者特定微生物混合物[1-3]。為了調(diào)節(jié)人體腸道，發(fā)揮益生作用，益生菌必須能夠在胃腸道中良好定殖，而對(duì)黏膜的黏附是定殖及增生的第一步[4-6]。益生菌的黏附能力可為其提供競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，是其在人體消化道中長(zhǎng)期定殖的必要條件。益生菌黏附過(guò)程包括菌體與不同接觸表面之間的非特異性物理作用和黏附素與特定受體間的特異性結(jié)合[7]。特異性黏附是通過(guò)特定的黏附素-受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)的；非特異性黏附則是通過(guò)疏水相互作用、靜電作用等進(jìn)行。闡明益生菌的黏附機(jī)理對(duì)于制備益生菌制劑和更好地認(rèn)識(shí)微生態(tài)學(xué)基本規(guī)律都具有十分重要的意義。

體外研究益生乳桿菌黏附最常用的方法是體外細(xì)胞培養(yǎng)法。人體結(jié)腸腺癌細(xì)胞系如Caco-2細(xì)胞株，因其在體外生長(zhǎng)所表現(xiàn)出的形態(tài)和功能特征可以模擬成熟腸道上皮細(xì)胞[8-9]，常作為體外模型來(lái)評(píng)價(jià)乳桿菌的黏附和定殖能力，但是體外培養(yǎng)細(xì)胞一般耗時(shí)較長(zhǎng)，耗費(fèi)較高，因此研究乳桿菌的自聚集能力和疏水性也可以為功能性益生乳桿菌的篩選提供參考。研究表明，疏水性與黏附性存在一定的相關(guān)性[10]，同時(shí)自聚集能力有助于生物膜形成，從而能夠抑制致病菌對(duì)人體腸道的侵襲，有助于促進(jìn)人體健康。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)10株不同植物乳桿菌的自聚集能力、表面疏水性和對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附性進(jìn)行研究，評(píng)價(jià)其黏附能力的高低，探究黏附與表面性質(zhì)的關(guān)系，為腸道益生乳桿菌的篩選和黏附機(jī)制的探討提供理論依據(jù)，同時(shí)通過(guò)對(duì)植物乳桿菌的化學(xué)處理，初步探討其黏附機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌種、細(xì)胞與培養(yǎng)基

10株受試植物乳桿菌為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，分離自新疆酸馬奶、酸駝奶、西藏靈菇，分別為：植物乳桿菌（Lactobacillus planturam，簡(jiǎn)寫(xiě)為L(zhǎng).p）AB1、L.p 3-4、L.p 9-5、L.p GCO10、L.p R2、L.p 3-1、L.p SR1-2、L.p A、L.p AB7、L.p M9-4。

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞株，購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司。

MRS培養(yǎng)基采用參考文獻(xiàn)[11]的方法制備；高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗（青霉素、鏈霉素溶液） 上海英駿生物技術(shù)公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-25型數(shù)顯pH計(jì)、離心機(jī) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；凈化工作臺(tái) 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；DNP-9272型生化培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱 江蘇省東臺(tái)電器廠；PHS-2F型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌的自聚集能力測(cè)定

按照Collado[12]和Tuo Yanfeng[13]等的方法并做適當(dāng)修改：10株植物乳桿菌分別以2%接種于滅菌后的液體MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)液4℃、10 000 r/min離心10 min，用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2次，然后重新懸浮于PBS中，調(diào)整細(xì)菌懸液濃度為107～108CFU/mL，取1 mL細(xì)菌懸液于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為A0，細(xì)菌懸液37℃靜置5 h后取1 mL上層清液至另一試管中，于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記為At。通過(guò)公式（1）計(jì)算自聚集能力。重復(fù)進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.3.2 植物乳桿菌的表面疏水性測(cè)定

參考Rosenberg等[14]的方法，并略加修改：按照1.3.1節(jié)的方法制備細(xì)菌懸液，再加入等體積的二甲苯，該兩相體系渦旋混合3 min，37℃靜置1 h后取出上清液，于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定水相的吸光度，記做A。按照公式（2）計(jì)算菌株的表面疏水性。重復(fù)進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，取平均值。

式中：A0和A分別表示植物乳桿菌懸液及兩相混合后水相的吸光度。

1.3.3 植物乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附

1.3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮罐中取出Caco-2細(xì)胞，將凍存管迅速置于37℃水浴中復(fù)蘇細(xì)胞，離心收集細(xì)胞后，加入5 mL DMEM完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、1%雙抗）后，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好時(shí)（70%～80%融合），用0.25%胰酶-乙二胺四乙酸消化傳代。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，隔4 d進(jìn)行傳代，傳代5次左右進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)。

1.3.3.2 植物乳桿菌懸液的制備

10株植物乳桿菌分別按2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20 h，于4℃、1 000 r/min離心10 min收集菌體。用無(wú)菌PBS（pH 7.2）洗滌3次，將菌體重懸于不含血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整菌懸液的濃度為1×108CFU/mL。

1.3.3.3 植物乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附觀察[15]

將細(xì)胞接種于含有蓋玻片的6 孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液一次，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層時(shí)，用無(wú)菌PBS（pH 7.2）洗滌1次，每孔中加入1 mL 1.3.3.2節(jié)所制備的細(xì)菌懸液（1×108CFU/mL）孵育1 h。用無(wú)菌PBS洗滌5次，以除去未黏附的細(xì)菌。甲醇固定30 min，自然晾干后進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察植物乳桿菌的黏附情況。

1.3.3.4 植物乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附計(jì)數(shù)

細(xì)菌、細(xì)胞培養(yǎng)與處理同前，除了將細(xì)菌懸浮液直接滴加于細(xì)胞培養(yǎng)孔中而不放置蓋玻片。經(jīng)PBS洗滌后用1%的Triton X-100裂解10 min，梯度稀釋后平板計(jì)數(shù)。另選取長(zhǎng)至單層的培養(yǎng)孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每個(gè)處理做3個(gè)平行，計(jì)算平均每個(gè)細(xì)胞黏附的細(xì)菌個(gè)數(shù)。

1.3.4 LiCl處理對(duì)植物乳桿菌自聚集能力和黏附能力的影響

10株植物乳桿菌分別以2%接種量接種于滅菌的液體MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20 h。培養(yǎng)液4℃、10 000 r/min離心10 min，用pH 7.2的PBS清洗2次后懸浮于1/5體積的5 mol/L LiCl溶液中，冰浴處理30 min，PBS清洗2次后，重復(fù)1.3.1節(jié)和1.3.3.4節(jié)的步驟。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌的自聚集能力

圖1 植物乳桿菌的自聚集能力Fig.1 Autoaggregation ability of L.planturam strains

由圖1可知，10株不同植物乳桿菌之間的自聚集能力從8.33%到63.39%，差異顯著（P＜0.05）。10株植物乳桿菌中，植物乳桿菌SR1-2的自聚集能力最差為8.33%。其中6株植物乳桿菌自聚集能力達(dá)到20%以上，植物乳桿菌A的自聚集能力最強(qiáng)為63.39%，而植物乳桿菌AB1、植物乳桿菌9-5、植物乳桿菌GCO10、植物乳桿菌R2、植物乳桿菌M9-4的自聚集能力均在20%～30%之間。

2.2 植物乳桿菌的表面疏水性

圖2 植物乳桿菌的表面疏水性Fig.2 Cell surface hydrophobicity of L.planturam strains

由圖2可知，10株不同植物乳桿菌的疏水性有所差異，其中植物乳桿菌3-4的表面疏水性最高（P＜0.05），達(dá)到67.90%，其次是植物乳桿菌A和植物乳桿菌M9-4，表面疏水性分別為60.37%和59.34%，植物乳桿菌AB1、植物乳桿菌9-5和植物乳桿菌GCO10表面疏水性均在45%～50%之間，植物乳桿菌3-1、植物乳桿菌AB7表面疏水性均在30%～40%之間。植物乳桿菌SR1-2的疏水性最低，為12.99%。

2.3 植物乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力

圖3 植物乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力（×1 000）Fig.3 Adhesion of L.planturam strains to Caco-2 cells by Gram staining under a light microscope (×1 000)

由圖3可知，植物乳桿菌菌體形態(tài)完整，并且能夠黏附在Caco-2細(xì)胞的周?chē)?，同時(shí)發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌A（圖3a）和植物乳桿菌3-4（圖3b）黏附數(shù)量明顯高于其他植物乳桿菌，植物乳桿菌3-1（圖3c）和植物乳桿菌SR1-2（圖3d）對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力較差，這與黏附計(jì)數(shù)的結(jié)果一致（圖4）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌A、植物乳桿菌3-4和植物乳桿菌3-1對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附較為規(guī)則，能整齊地黏附在細(xì)胞周?chē)?/p>

圖4 植物乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附分析Fig.4 Adhesion ability to Caco-2 cell of L.planturam strains

由圖4可知，不同植物乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力存在顯著差異（黏附數(shù)量為20.00～170.31，P＜0.05），其中植物乳桿菌SR1-2黏附數(shù)量最少，黏附能力最差，植物乳桿菌3-4黏附數(shù)量最多，黏附能力最強(qiáng)。10株實(shí)驗(yàn)植物乳桿菌中，植物乳桿菌3-4、植物乳桿菌9-5、植物乳桿菌R2、植物乳桿菌A和植物乳桿菌M9-4對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附數(shù)量均高于100，植物乳桿菌GCO10和植物乳桿菌AB1對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附數(shù)量在90～100之間，其余植物乳桿菌的黏附數(shù)量在20～60之間，黏附能力較差。

2.4 植物乳桿菌表面性質(zhì)和黏附能力的相關(guān)性分析

圖5 植物乳桿菌自聚集能力、表面疏水性和對(duì)細(xì)胞黏附能力的比較分析Fig.5 Comparative analysis of autoaggregation, cell surface hydrophobicity and adhesion ability of L.planturam strains

由圖5可知，植物乳桿菌的自聚集能力、表面疏水性和黏附能力存在一定的相關(guān)性。其中，表面疏水性與黏附能力存在顯著相關(guān)性（P＜0.05），表面疏水性高的植物乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力相應(yīng)也高，表面疏水性低的植物乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞黏附能力也較低。如植物乳桿菌3-4疏水性最強(qiáng)，相應(yīng)地對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附數(shù)量也最多，其次是植物乳桿菌A，疏水性較強(qiáng)，相應(yīng)地對(duì)細(xì)胞的黏附數(shù)量也較多，而植物乳桿菌SR1-2表面疏水性最弱，相應(yīng)地對(duì)細(xì)胞的黏附數(shù)量也最少，黏附能力最差。

由圖5可知，除植物乳桿菌3-4和植物乳桿菌A以外，植物乳桿菌的自聚集能力與黏附能力也存在著一定正相關(guān)。自聚集能力強(qiáng)，細(xì)胞黏附數(shù)量較高，黏附能力也較強(qiáng)。植物乳桿菌3-4對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附數(shù)量最多，但其自聚集能力并不是最強(qiáng)的，而植物乳桿菌A的自聚集能力最強(qiáng)，但對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附數(shù)量卻不是最多的。說(shuō)明植物乳桿菌的自聚集能力與細(xì)胞黏附能力的關(guān)系在菌株間存在著差異性。

2.5 LiCl處理對(duì)植物乳桿菌自聚集能力和黏附能力的影響

由圖6可知，與LiCl處理前的菌體細(xì)胞相比，經(jīng)5 mol/L的LiCl處理后的菌體細(xì)胞自聚集能力明顯降低。

圖6 LiCl處理前后植物乳桿菌自聚集能力的變化Fig.6 Comparison of autoaggregation ability of L.planturam strains before and after LiCl treatment

圖7 LiCl處理前后植物乳桿菌對(duì)Caco-2黏附能力的變化Fig.7 Comparison of adhesion ability of L.planturam strains before and after LiCl treatment

由圖7可知，經(jīng)5 mol/L的LiCl處理后，植物乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力也明顯降低。植物乳桿菌R2、植物乳桿菌3-1和植物乳桿菌SR1-2對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附數(shù)量幾乎為0，說(shuō)明蛋白類(lèi)物質(zhì)在這3株植物乳桿菌的黏附過(guò)程中起著重要的作用。而其他植物乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附數(shù)與LiCl處理前相比，雖有不同程度的降低，但依然保持較多的細(xì)胞黏附數(shù)量，說(shuō)明這些菌株對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附過(guò)程不僅有蛋白類(lèi)物質(zhì)起作用，還有其他因素的作用。

3 結(jié)論與討論

植物乳桿菌對(duì)腸道細(xì)胞的黏附和定殖是其發(fā)揮阻止外源病原菌入侵、清除腸道有害物質(zhì)、保護(hù)胃腸黏膜等益生作用的先決條件。由于直接在體內(nèi)研究植物乳桿菌對(duì)人腸道上皮細(xì)胞的黏附作用具有一定困難，因此本實(shí)驗(yàn)以人結(jié)腸癌腺細(xì)胞系Caco-2為模型，采用顯微鏡觀察和平板計(jì)數(shù)的方法研究植物乳桿菌對(duì)細(xì)胞黏附狀態(tài)和數(shù)量的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)10株植物乳桿菌對(duì)細(xì)胞的黏附能力存在菌株差異性，王麗群[16]和del Re[17]等對(duì)雙歧桿菌的黏附能力進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同種類(lèi)雙歧桿菌之間也存在著黏附能力的差異性，由此可見(jiàn)，黏附能力與植物乳桿菌的自身性質(zhì)存在著必然聯(lián)系。

大量的研究結(jié)果表明，細(xì)菌的黏附能力與菌體表面性質(zhì)存在較大的相關(guān)性[18-20]，研究黏附能力與表面性質(zhì)的關(guān)系不僅可以通過(guò)表面性質(zhì)快速篩選具有黏附性質(zhì)的益生菌，同時(shí)可以初步判斷黏附機(jī)制。自聚集能力和表面疏水性通常被認(rèn)為是反映菌體黏附能力的兩個(gè)特征。自聚集能力在細(xì)菌生物膜的形成過(guò)程中起著舉足輕重的作用，同時(shí)自聚集能力的大小也影響著乳桿菌在人體腸道內(nèi)定殖情況，表面疏水作用對(duì)于乳桿菌在人體腸道的定殖具有良好的促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)選用10株植物乳桿菌，研究其黏附能力與自聚集能力和表面疏水性的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黏附能力與表面疏水性存在顯著相關(guān)性，這與陳臣等[5]的研究一致。此外，已有研究通過(guò)測(cè)定表面疏水性來(lái)間接反映細(xì)菌的黏附能力大小，細(xì)菌表面疏水性越大，則其黏附能力越強(qiáng)[21-22]。而黏附能力與自聚集能力的關(guān)系在菌株間存在差異性，與Tuo Yanfeng[13]和Vlková[23]等的研究結(jié)果一致。因此，自聚集能力和表面疏水性可作為篩選高黏附能力植物乳桿菌的參考指標(biāo)。

黏附不僅涉及與表面性質(zhì)有關(guān)的非特異性黏附，還包括與黏附素有關(guān)的特異性黏附[24]。與黏附有關(guān)的物質(zhì)包括蛋白質(zhì)、多肽、糖蛋白、糖脂和多糖或單糖等。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)LiCl處理后的植物乳桿菌自聚集能力和黏附能力均有所下降，表明蛋白類(lèi)物質(zhì)在植物乳桿菌自聚集和黏附過(guò)程中起到一定作用；除植物乳桿菌R2、植物乳桿菌3-1和植物乳桿菌SR1-2外，其余植物乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞仍有黏附作用，說(shuō)明除蛋白質(zhì)外，其他黏附素在黏附過(guò)程中起主要作用，其黏附機(jī)制和黏附素的確定有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)對(duì)10株從新疆酸馬奶、酸駝奶、西藏靈菇中分離的植物乳桿菌進(jìn)行自聚集能力、表面疏水性和對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力研究，發(fā)現(xiàn)自聚集能力與黏附能力存在菌株之間的差異性，而表面疏水性和黏附能力之間存在顯著正相關(guān)，為高黏附植物乳桿菌的篩選提供了簡(jiǎn)單、合理、有效的篩選方法。通過(guò)比較LiCl處理前后植物乳桿菌自聚集能力和黏附能力的變化，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌對(duì)細(xì)胞的黏附不僅與蛋白質(zhì)有關(guān)，其他黏附因素也起到至關(guān)重要的作用。今后的研究將進(jìn)一步確定與黏附有關(guān)的物質(zhì)及黏附機(jī)制。此外，具有高黏附能力的乳桿菌有利于調(diào)節(jié)人體腸道健康，為食品應(yīng)用及功能性食品的開(kāi)發(fā)提供可能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物乳桿菌3-4和植物乳桿菌A具有良好的黏附能力，其表面黏附物質(zhì)的屬性及在黏附中發(fā)揮作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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