張金迪，樊金玲*，楊 睿，朱文學(xué)，孫曉菲

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003）

β-胡蘿卜素是一種廣泛存在于水果和蔬菜中的脂溶性營養(yǎng)成分[1]，是人體VA的主要來源，具有抗癌、預(yù)防心血管疾病等多種功能，可防止老化和衰老引起的多種退化性疾病[2-3]。β-胡蘿卜素的生物利用過程包括：從食品基質(zhì)中釋放至消化液→在小腸內(nèi)形成脂質(zhì)膠束→被小腸黏膜細(xì)胞吸收→被轉(zhuǎn)運至門脈及淋巴循環(huán)及在肝臟中轉(zhuǎn)化為VA或被儲存4個步驟[4]。在體外實驗中，常用β-胡蘿卜素從食品基質(zhì)中釋放到胃腸道隨后被包被在脂質(zhì)微粒中程度——即“生物接近度”來評價食物中β-胡蘿卜素的生物利用率。食物中的β-胡蘿卜素在人體內(nèi)的利用率較低[5]，原因可能與β-胡蘿卜素在食物基質(zhì)中被包被、水溶性差以及化學(xué)不穩(wěn)定性等有關(guān)[6]。因此，制備高生物利用率的β-胡蘿卜素功能性食品和膳食補(bǔ)充劑具有廣闊的市場前景。

采用高壓均質(zhì)技術(shù)制備乳狀液作為β-胡蘿卜素的載體，克服了其不溶于水及易被氧化等缺點，可有效提高其生物利用率[7-8]。許多因素影響乳狀液中β-胡蘿卜素的生物利用率，如油滴粒徑、脂肪含量和性質(zhì)、β-胡蘿卜素濃度及乳化劑的類型等。Wang Pan[9]、Salvia-Trujillo[10]和Yi Jiang[11]等的研究表明，β-胡蘿卜素的生物接近度隨乳狀液中油滴粒徑的減小而增大。Salvia-Trujillo[12]和McClements[13]等報道了β-胡蘿卜素的生物接近度隨乳狀液中油相含量的升高而增大；但是也有研究發(fā)現(xiàn)：均質(zhì)處理前在胡蘿卜泥中加入油脂（5%橄欖油）對β-胡蘿卜素的生物接近度無顯著影響[14]。Qian Cheng等[6]的研究表明載體油類型影響乳狀液中β-胡蘿卜素的生物接近度，油相分別為長鏈脂肪酸（玉米油）、中鏈脂肪酸（Miglyol 812）和不被消化的風(fēng)味油（橙油）時，β-胡蘿卜素的生物接近度逐漸降低（分別為66%、2%、0%）。Wang Pan等[9]的研究表明油相中β-胡蘿卜素的含量在0.025%～0.050%范圍內(nèi)時，其膠束化率逐漸降低，但當(dāng)β-胡蘿卜素的含量繼續(xù)增加時，其膠束化率沒有明顯變化。Liu Yuwei等[15]的研究表明不同乳化劑（司盤-20、乳清分離蛋白、可溶性大豆多糖）影響乳狀液的物理性質(zhì)、微觀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響β-胡蘿卜素的生物接近度，其生物接近度大小順序為：乳清分離蛋白＞司盤-20＞可溶性大豆多糖。

本實驗以膠束化率為指標(biāo)、采用靜態(tài)體外消化法研究吐溫-20作為乳化劑制備的乳狀液中β-胡蘿卜素的生物接近度，著重探討β-胡蘿卜素的膠束化過程、均質(zhì)壓力和次數(shù)、β-胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和油相含量對乳狀液中β-胡蘿卜素生物接近度的影響規(guī)律及可能機(jī)制。以期為乳狀液形式的β-胡蘿卜素膳食補(bǔ)充劑和強(qiáng)化劑的開發(fā)和研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全反式β-胡蘿卜素（產(chǎn)品號：101335477，純度≥98%）美國Sigma公司。

吐溫-20（分析純） 上海山浦化工有限公司；正己烷、丙酮、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純 天津德恩化學(xué)試劑廠；胃蛋白酶、胰酶、膽鹽均為生化級 美國Sigma公司；大豆油（食品級） 中糧食品營銷有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GYB50-6S高壓均質(zhì)機(jī) 上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠；QYC-2102C恒溫培養(yǎng)搖床 上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；FA1004分析天平 上海上平儀器公司；TGL-18C高速臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；NPW-12水浴氮吹儀 合肥艾本科學(xué)儀器有限公司；36X生物顯微鏡上海巴拓儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 全反式β-胡蘿卜素樣品定性分析

采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對全反式β-胡蘿卜素樣品進(jìn)行定性分析。

HPLC條件：色譜柱：YMC C30（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動相A：甲醇，流動相B：甲基叔丁基醚。洗脫條件：0～10 min 50% A。檢測器波長范圍：190～550 nm；檢測波長：450 nm。

1.3.2 β-胡蘿卜素乳狀液的制備

油相制備：將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的β-胡蘿卜素和大豆油混合，超聲波處理5 min，低于50℃加熱攪拌5 min，使β-胡蘿卜素完全溶解于大豆油中。

水相制備：10.0 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）。

將5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的油相、1.5%的吐溫-20和93.5%的水相混合，1 000 r/min剪切5 min，高壓均質(zhì)機(jī)20 MPa均質(zhì)1次，得到β-胡蘿卜素乳狀液。

為研究油相含量對β-胡蘿卜素生物接近度的影響，乳狀液中油相含量分別選擇1%、2%、4%、5%、7%、9%、10%、12%、15%、18%、20%。為研究β-胡蘿卜素濃度對生物接近度的影響，分別制備β-胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2、5、10、15、20、30 mg/100 g的乳狀液。

1.3.3 體外消化法

該方法參考文獻(xiàn)[16-18]并做適當(dāng)修改。

胃消化法：稱取5 g β-胡蘿卜素乳狀液置于150 mL錐形瓶中，加入10 mL電解質(zhì)溶液（50 mmol/L NaCl、14 mmol/L KCl、3.5 mmol/L KH2PO4、10 mmol/L CaCl2?2H2O、3.6 mmol/L MgCl2?6H2O），1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至2.0，加入2 mL胃蛋白酶液（50.25 mg/mL，胃蛋白酶溶于0.1 mol/L HCl）保鮮膜封口放入搖床，于37℃、95 r/min消化1 h。

腸消化法：取出錐形瓶，用1 mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至6.90±0.01，加入9 mL膽鹽-胰酶液（31.13 mg/mL、5 mg/mL；膽鹽、胰酶溶于0.1 mol/L NaHCO3），封口放入搖床，于37℃、95 r/min消化2 h。

1.3.4 生物接近度（膠束化率）的測定

上述消化過程結(jié)束后，于5 000×g離心10 min得到上清液，上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜得到膠束（用于分析β-胡蘿卜素可能被小腸吸收的程度——膠束化率）。

膠束中β-胡蘿卜素的萃取：避光條件下，在膠束中加入等體積萃取劑，輕微振蕩，靜置分層；反復(fù)萃取至無色，合并萃取液；用氮吹儀吹干后復(fù)溶，待測。

β-胡蘿卜素質(zhì)量濃度的測定：采用紫外-可見分光光度計于450 nm波長處定量測定待測樣品中β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度。通過下式計算β-胡蘿卜素的膠束化率。

式中：ρ1為膠束中β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；ρ2為乳狀液中β-胡蘿卜素的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V1為膠束體積/mL；V2為乳狀液體積/mL。

腸消化不同時間乳狀液中β-胡蘿卜素的相對膠束化率按照下式計算。

式中：B為腸消化不同時間乳狀液中β-胡蘿卜素的膠束化率/%；B120min為腸消化120 min時乳狀液中β-胡蘿卜素的膠束化率/%。

1.3.5 粒度分析

用光學(xué)顯微鏡（放大16×40倍）觀察β-胡蘿卜素乳狀液以及胃消化前后、腸消化前后消化液的微觀結(jié)構(gòu)。顯微圖片由Canon IXUS 125 HS相機(jī)拍攝。油滴粒徑通過圖像處理軟件Adobe Photoshop CS5測定[19]。油滴粒徑dn由式（3）計算得出，平均粒徑-d由式（4）計算得出，體積百分比由式（5）計算得出。

式中：dn’為通過顯微圖片測得的油滴粒徑/mm；16×40為顯微鏡的放大倍數(shù)；1 000為μm與mm間的換算倍數(shù)。

式中：n為顯微圖片中油滴個數(shù)。

式中：Vn為粒徑為dn油滴的體積和/μm3；V為所有油滴的總體積/μm3。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗重復(fù)3次。用DPS 3.01數(shù)據(jù)處理軟件，對實驗結(jié)果進(jìn)行0.01水平上的單因素試驗統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 全反式β-胡蘿卜素HPLC分析結(jié)果

圖1為全反式β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖和全波長掃描光譜圖。可知本標(biāo)準(zhǔn)品不含有其他異構(gòu)體。

圖1 全反式β-胡蘿卜素的HPLC圖（450 nm）（a）及全波長掃描光譜圖（b）Fig.1 HPLC chromatogram (at 450 nm) (a) and UV absorption spectrum (b) of all-trans-β-carotene

2.2 體外消化體系中β-胡蘿卜素的膠束化過程

圖2 乳狀液中β-胡蘿卜素在不同消化時間的膠束化率和相對膠束化率Fig.2 Ratio and relative ratio of β-carotene transferred from the emulsion to a micellar phase at different digestion times

圖2為乳狀液中β-胡蘿卜素經(jīng)腸消化不同時間（2、5、8、12、18、30、60、90、120 min）的膠束化率和對應(yīng)得到的相對膠束化率。可知在腸消化初始階段的0～12 min內(nèi)，β-胡蘿卜素的膠束化率增長很快：如腸消化2 min時，β-胡蘿卜素的膠束化率和相對膠束化率分別為4.26%、47.7%；腸消化12 min時，β-胡蘿卜素的膠束化率和相對膠束化率分別已經(jīng)達(dá)到7.12%、79.8%；腸消化12～30 min階段，β-胡蘿卜素的膠束化率增長變緩，相對膠束化率由79.8%增加至94.4%；30 min之后無明顯變化。β-胡蘿卜素的膠束化過程與脂肪水解過程密切相關(guān)；脂肪在胰脂肪酶的作用下生成的脂肪酸，與膽鹽等共同形成膠束，大油滴同時變成小油滴，位于油滴中的

圖3 胃腸消化過程中乳狀液微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig.3 Microstructural changes of the emulsion during gastrointestinal digestion

β-胡蘿卜素遷移至膠束中進(jìn)而被吸收。實驗觀察了胃消化前后、腸消化前后消化液中分散相（即油滴）的微觀結(jié)構(gòu)變化（消化液用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋5倍）。如圖3所示，胃消化后部分油滴發(fā)生明顯的聚集現(xiàn)象，Salvia-Trujillo等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象。這一現(xiàn)象可能和消化液pH值的變化以及機(jī)械振蕩有關(guān)。一方面，胃液的酸性環(huán)境可引起油滴的絮凝或聚結(jié)，另一方面，模擬胃消化過程中的蠕動所采用的振蕩則有利于油滴的分散，油滴聚結(jié)速率和分散速率相對平衡時，乳狀液中液滴的大小也相對恒定[10,20]。在腸消化階段起始時（即腸消化前），油滴聚集現(xiàn)象減弱；這可能與加入膽鹽-胰酶液對消化液稀釋作用、溶液成分和pH值的變化有關(guān)[21]。消化液濃度的減小減弱了油滴間疏水相互作用，離子強(qiáng)度和pH值的變化改變了液滴之間的靜電相互作用，從而破壞了油滴的聚合[10]。腸消化結(jié)束后的顯微觀察圖中基本看不到油滴，說明大粒徑油滴已經(jīng)被脂肪酶水解。Amyoony[20]的研究也表明，腸消化時脂肪分解速率最快在前4 min，30 min時脂肪分解率基本達(dá)到最大值。脂肪的變化過程與本研究中β-胡蘿卜素膠束化率的變化過程相吻合，從一定程度上說明了脂肪水解與β-胡蘿卜素膠束化過程的相關(guān)性，而腸消化前30 min是脂肪水解和β-胡蘿卜素膠束化過程的重要階段。

2.3 均質(zhì)壓力和次數(shù)對乳狀液中β-胡蘿卜素生物接近度的影響

圖4 不同均質(zhì)壓力對乳狀液中β-胡蘿卜素生物接近度的影響Fig.4 Effect of different homogenization pressures on the bioaccessibility of β-carotene incorporated in emulsions

研究不同均質(zhì)壓力（0、10、20、30、35 MPa）對乳狀液中β-胡蘿卜素生物接近度的影響，結(jié)果如圖4所示。β-胡蘿卜素生物接近度隨均質(zhì)壓力的升高而增大，除均質(zhì)壓力為20、30 MPa之間的差異不顯著外，其余均達(dá)到顯著水平。如未經(jīng)均質(zhì)處理的樣品中β-胡蘿卜素的膠束化率僅為0.98%，均質(zhì)壓力為10、20、35 MPa時，膠束化率分別增加至3.23%、8.71%和10.87%，約是未均質(zhì)樣品的3.3、8.9、11倍。

圖5 不同均質(zhì)壓力下β-胡蘿卜素乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)Fig.5 Microstructures of β-carotene emulsions homogenized at 10, 20,30 and 35 MPa

圖6 不同均質(zhì)壓力下β-胡蘿卜素乳狀液的粒度分布Fig.6 Particle size distribution of β-carotene emulsions homogenized at 10, 20, 30 and 35 MPa

圖5為不同均質(zhì)壓力下β-胡蘿卜素乳狀液的顯微圖片，圖6為其對應(yīng)的粒度分布情況。隨著均質(zhì)壓力的增大，乳狀液中油滴的平均粒徑減小，粒徑分布范圍也越來越窄。如10 MPa時，乳狀液中油滴粒徑范圍約為1.56～14.06 μm，平均粒徑約為4.28 μm；均質(zhì)壓力為20、30、35 MPa時，乳狀液中油滴粒徑范圍分別約為 0.39～7.81、0.16～3.91、0.16～2.34 μm，油滴平均粒徑分別減小至1.60、0.86、0.44 μm，乳狀液中油滴的平均粒徑和膠束化率的關(guān)系如圖7所示，油滴的平均粒徑與膠束化率呈線性負(fù)相關(guān)，即膠束化率隨油滴平均粒徑的減小而增大。

圖7 油滴平均粒徑和膠束化率的關(guān)系Fig.7 Relationship between average oil droplet size and the ratio of β-carotene incorporated into micelles

β-胡蘿卜素生物接近度的影響Fig.8 Effect of different homogenization cycles on the bioaccessibility of β-carotene incorporated in emulsions圖8 不同均質(zhì)次數(shù)對乳狀液中

研究不同均質(zhì)次數(shù)（1、2、3次）對乳狀液中β-胡蘿卜素生物接近度的影響，結(jié)果如圖8所示。隨著均質(zhì)次數(shù)的增加，β-胡蘿卜素的膠束化率顯著降低：20 MPa均質(zhì)1次的膠束化率分別約為2次的1.3倍，3次的2.7倍。高壓均質(zhì)過程中大油滴被剪切為小油滴，一方面使脂肪與消化酶之間作用的表面積增大[13]，更多的油滴被水解為脂肪酸，從而形成更多的膠束；另一方面，由于油滴粒徑的減小，也使得β-胡蘿卜素從油滴中轉(zhuǎn)移至膠束中的遷移半徑減小，遷移阻力隨之減??；β-胡蘿卜素的膠束化率也因此得到提高。Wang Pan[9]和Salvia-Trujillo[10]等也報道了β-胡蘿卜素的生物接近度隨油滴粒徑的減小而增加，這與本實驗中均質(zhì)壓力對β-胡蘿卜素生物接近度影響的研究結(jié)果一致。但是本實驗同時發(fā)現(xiàn)，在同一均質(zhì)壓力條件下，增加均質(zhì)次數(shù)同樣可使油滴粒徑減小，而β-胡蘿卜素的膠束化率卻意外地顯著降低，說明除油滴粒徑外的其他因素影響了β-胡蘿卜素的膠束化率。隨著均質(zhì)次數(shù)增加，乳狀液形成過程中分散液滴表面形成的界面膜強(qiáng)度的緊密程度增大[22]，β-胡蘿卜素難以從油滴中釋放轉(zhuǎn)移至膠束中。

2.4 油相含量對乳狀液中β-胡蘿卜素生物接近度的影響

圖9 不同油相含量乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)Fig.9 Microstructures of emulsions containing different oil contents

圖9為不同油相含量（5%、10%、15%、20%）乳狀液的顯微圖片（用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋5倍）。隨著油相含量的增加，乳狀液中油滴越來越多，分布越來越密集，但油滴的平均粒徑差別不大，約為1.60 μm。

β-胡蘿卜素生物接近度的影響Fig.10 Effects of different oil contents on the bioaccessibility of β-carotene incorporated in emulsions圖10 不同油相含量對乳狀液中

不同油相含量對乳狀液中β-胡蘿卜素的膠束化率影響如圖10所示。β-胡蘿卜素的膠束化率隨著油相含量的增加呈“S”型增長趨勢。當(dāng)油相含量小于2%時，β-胡蘿卜素的膠束化率增長緩慢；當(dāng)油相含量為2%～18%時，β-胡蘿卜素的膠束化率增長較快；而當(dāng)油相含量大于18%時，β-胡蘿卜素的膠束化率不再繼續(xù)增長，維持在一較高的水平（42.51%）。當(dāng)油相含量在一定范圍內(nèi)時，隨著其含量增大，更多的油脂被脂肪酶消化形成脂肪酸，參與膠束的形成，因此β-胡蘿卜素的膠束化率隨之上升。由于消化體系中脂肪酶和膽鹽的濃度是一定的，限制了其對更多脂肪水解和膠束形成的影響，因此，當(dāng)油相含量增大至某一水平以上時，β-胡蘿卜素的膠束化率不再隨之變化，而是維持在一個較高的水平。

諸多研究者報道了油相含量對β-胡蘿卜素生物接近度的影響，但結(jié)論卻有較大差異。Salvia-Trujillo等[12]的研究表明乳狀液中油相含量增加4倍（1%～4%）時，β-胡蘿卜素的生物接近度增加了6倍（14%～84%）；Hornero-Méndez等[23]研究也發(fā)現(xiàn)添加5%的油可以提高類胡蘿卜素的膠束化率。但Svelander[24]的研究表明油的存在和類胡蘿卜素的生物接近度沒有明顯的相關(guān)性；Knockaert等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，均質(zhì)處理前在胡蘿卜泥中加入油脂（5%橄欖油）對β-胡蘿卜素的生物接近度無顯著影響。本實驗結(jié)果則表明油相含量對β-胡蘿卜素生物接近度的影響與油相含量的范圍有關(guān)。如實驗所獲得的“S”型曲線的前段和后段，即油相含量較低（1%～2%）或較高（18%～20%）時，對β-胡蘿卜素生物接近度影響不顯著，而在“S”型曲線的中段，β-胡蘿卜素生物接近度隨油相含量的增加而顯著增大。這一結(jié)果部分解釋了前人研究結(jié)論在表面上相互矛盾的原因。

2.5 乳狀液中β-胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)對其生物接近度的影響

圖11 β-胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳狀液中β-胡蘿卜素生物接近度的影響Fig.1 Effect of β-carotene concentration on the bioaccessibility of β-carotene incorporated in emulsions

研究乳狀液中β-胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)對其生物接近度的影響，結(jié)果如圖11所示。隨著乳狀液中β-胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，其膠束化率先上升后下降，而膠束中β-胡蘿卜素的絕對質(zhì)量則呈先上升而后進(jìn)入平臺期的變化趨勢。由于體系中油相和膽鹽含量是一定的，形成膠束的最大能力也是一定的，從而使膠束包被β-胡蘿卜素的能力也相應(yīng)地存在一個飽和值。β-胡蘿卜素在消化液中可能以4種形式存在：包被于膠束中、溶于油滴、附于可溶性聚合物中或呈不溶狀態(tài)[25]。本實驗發(fā)現(xiàn)，消化液經(jīng)離心后的沉淀部分有些是橘黃色，部分油相被水解成脂肪酸，溶于其中的β-胡蘿卜素在消化液中呈不溶狀態(tài)，經(jīng)離心沉淀出來。

3 結(jié) 論

在一定范圍內(nèi)，β-胡蘿卜素的膠束化率與乳狀液中油滴平均粒徑線性負(fù)相關(guān)；β-胡蘿卜素的生物接近度隨油相含量增加而增加，達(dá)到一定值時趨于飽和；乳狀液中β-胡蘿卜素的膠束化率隨其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加先上升后降低，而膠束中β-胡蘿卜素的絕對質(zhì)量則呈先上升而后進(jìn)入平臺期的變化趨勢。

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