李 俶，翟宇鑫，陳 軍,*，王謝祎，劉繼延，程 超，劉成梅

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.江西齊云山食品有限公司，江西 贛州 341000）

南酸棗又名五眼果，是蒙藥習(xí)用藥材[1]。劉曉庚等[2]通過測定南酸棗果實(shí)中的營養(yǎng)成分發(fā)現(xiàn)，其含有豐富的單寧、皂苷、黃酮、多酚等生物活性成分。其中多酚類化合物是一種具有顯著抗氧化性、抗腫瘤、抗炎癥等作用的營養(yǎng)物質(zhì)，近幾年對其來源、功能性質(zhì)的研究越來越受到關(guān)注[3]。目前，有關(guān)植物中多酚類化合物的研究比較活躍，主要集中于多酚類化合物提取研究方面[4-6]。然而伴隨著日常飲食攝入，食品中的多酚類化合物在體內(nèi)能否充分釋放，并為人體利用進(jìn)而發(fā)揮其各種功能，則需要進(jìn)一步研究其在體內(nèi)的消化、代謝和利用[7-8]。然而，體內(nèi)消化研究面臨著復(fù)雜度高和道德倫理兩大難題，而體外模擬胃腸液消化實(shí)驗(yàn)具有簡單、快速、成本低、重復(fù)性較高等優(yōu)點(diǎn)，可用于替代體內(nèi)消化實(shí)驗(yàn)而被廣泛應(yīng)用[9-10]。袁春龍等[11]利用體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葡萄籽多酚類化合物的消化主要發(fā)生在胃中。江慎華等[12]發(fā)現(xiàn)人工胃液處理后，丁香有效部位抗氧化活性得到顯著提高，而人工腸液處理后，其抗氧化活性卻顯著降低。

近幾年，隨著江西齊云山食品有限公司對南酸棗系列產(chǎn)品的開發(fā)，使得綜合利用富含多酚類化合物的南酸棗皮及工業(yè)化生產(chǎn)變得日益重要。本實(shí)驗(yàn)通過體外模擬胃腸液消化環(huán)境與溶劑提取相比較，考察不同處理方式對南酸棗皮中總多酚、總黃酮、原花青素釋放的影響，以期為南酸棗皮類產(chǎn)品的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，提高南酸棗皮的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南酸棗皮，由江西齊云山食品有限公司提供。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99.9%）、牛膽鹽 上海晶純實(shí)業(yè)有限公司；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、胃蛋白酶、胰蛋白酶 美國Sigma公司；MD44透析袋 北京Solarbio公司；乙醇、鹽酸、甲醇為分析純 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；Folin-酚試劑 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；無水Na2CO3、NaCl、NaHCO3、AlCl3、NaOH、NaNO2、C8H8O3（香草醛）均為分析純 西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；SHB-3型循環(huán)水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；HH-4型恒溫數(shù)顯水浴鍋 金壇市城西曉陽電子儀器廠；AR1140型分析天平 美國Oahus公司；DFY-500型植物粉碎機(jī) 大德藥劑有限公司；分樣篩 思科儀器紗篩廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

南酸棗去肉取皮，洗凈，50℃條件下烘干，粉碎過100 目篩，20℃條件下保存待分析。

1.3.2 人工胃液制備[13]

分別于兩個100 mL具塞錐形瓶中加入9 mg/mL NaCl溶液25 mL、0.1 mol/L鹽酸溶液4 mL、4 mg/mL胃蛋白酶溶液4 mL（用0.1 mol/L鹽酸配制），混合均勻后，調(diào)pH值為2～2.5。各加入1.000 0 g樣品，于37℃、100 r/min水浴振蕩1 h。一份過濾得上清液后于－20℃條件下保存待分析，另一份繼續(xù)進(jìn)行腸液消化。

1.3.3 人工腸液透析

將透析袋用9 mg/mL NaCl溶液內(nèi)外清洗干凈，一端用棉線系緊，加入 9 mg/mL NaCl溶液8 mL，0.5 mol/L NaHCO3溶液2 mL，后系緊另一端，放入上述胃消化液中，于37℃、100 r/min水浴振蕩45 min，通過透析袋的選擇透過性，緩慢改變消化液pH值，該過程是在模擬食物從胃部向腸道的過渡階段。

此時，具塞錐形瓶中液體pH值為6.5～7.0附近，于透析袋外加入18 mL胰液膽汁混合液（0.2 mg/mL胰液，1.2 mg/mL膽汁），于37℃、100 r/min水浴振蕩2 h，取出透析袋，將透析袋內(nèi)液體于－20℃條件下保存待分析，具塞錐形瓶中液體過濾得上清液，后于－20℃條件下保存待分析。

1.3.4 生物利用率測定[14]

生物利用率是指從食物中釋放出來，在小腸壁的阻礙及選擇透過作用下，可進(jìn)入血液被人體吸收利用的營養(yǎng)物質(zhì)占食入食物總量的比例。按照公式（1）計算各成分的生物利用率。

式中：C透析為該成分在透析袋內(nèi)的含量/（mg/g）；C非透析為該成分在腸道內(nèi)的總含量/（mg/g）。

1.3.5 溶劑提取方法

1.3.5.1 傳統(tǒng)熱水浸提法[15]

精確稱取1.000 0 g樣品于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL蒸餾水，于90℃水浴鍋中回流提取60 min，過濾，重復(fù)上述過程3次，合并濾液定容于250 mL，后于－20℃條件下保存待分析。

1.3.5.2 超聲波輔助乙醇提取法[16]

精確稱取1.000 0 g樣品于100 mL具塞錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)52%乙醇溶液30 mL，超聲波提取40 min，過濾，重復(fù)上述過程3次，合并濾液定容于250 mL后于－20℃條件下保存待分析。

1.3.6 Folin-酚法測定總多酚釋放量1.3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱量1.000 0 g沒食子酸，用5 mL乙醇溶解，加水定容至50 mL，分別移取0.5、1.0、1.5、2.5、5.0 mL到50 mL容量瓶中，用水定容。從上述不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別移取1 mL加入到50 mL容量瓶中，再分別加入30 mL蒸餾水，混合后加入2.5 mL Folin-酚試劑，混合后在5～8 min內(nèi)加入7.5% Na2CO3溶液2 mL，混合后加水定容。用上述方法制備空白試樣，將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白試樣在20℃條件下避光放置2 h后，在760 nm波長處測定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=0.780 7x+0.073 7（R2=0.999 3）。

1.3.6.2 樣品總多酚釋放量測定

準(zhǔn)確移取1 mL提取液于50 mL容量瓶中，按照1.3.6.1節(jié)方法進(jìn)行操作，在760 nm波長處測定吸光度，并根據(jù)回歸方程，按照公式（2）計算提取液中總多酚釋放量（以沒食子酸當(dāng)量計）。

式中：ρ1為提取液中總多酚釋放量/（mg/mL）；V1為提取液總體積/mL；m為南酸棗皮樣品質(zhì)量/g。

1.3.7 NaNO2-AlCl3-NaOH顯色法測定總黃酮釋放量

1.3.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取1 mg/mL兒茶素對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL分別置于10 mL比色管中，用水定容。從上述不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別移取1 mL加入到10 mL比色管中，加入適量蒸餾水，先加5 g/100 mL NaNO2溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，再加10 g/100 mL AlCl3溶液0.5 mL，搖勻放置6 min，加4 g/100 mL NaOH溶液3 mL，用蒸餾水定容到10 mL，搖勻放置15 min，以試劑空白為參比，于510 nm波長處測定吸光度，以兒茶素對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為 y=3.116 9x－0.065 6（R2=0.999 8）。

1.3.7.2 樣品總黃酮釋放量測定

精密吸取1 mL提取液置于10 mL比色管中，按照1.3.7.1節(jié)方法進(jìn)行操作，于510 nm波長處測定吸光度，并根據(jù)回歸方程，按照公式（3）計算提取液中總黃酮的釋放量（以兒茶素當(dāng)量計）。

式中：ρ1為提取液中總黃酮釋放量/（mg/mL）；V1為提取液總體積/mL；m為南酸棗皮樣品質(zhì)量/g。

1.3.8 香草醛-甲醇-鹽酸顯色法測定原花青素釋放量[17]

1.3.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱量0.100 0 g兒茶素，加甲醇定容至100 mL，分別移取4、5、6、7、8、9 mL分別置于10 mL比色管中，用甲醇定容。從上述不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別移取1 mL加入到10 mL比色管中，加入4 g/100 mL的香草醛-甲醇溶液6 mL混勻，加入濃鹽酸3 mL混勻，30℃條件下避光靜置10 min。用紫外分光光度計在500 nm波長處測定吸光度。以甲醇空白為參比，以兒茶素對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=2.093 6x+0.046 1（R2=0.996 3）。

1.3.8.2 樣品原花青素釋放量測定

精密吸取1 mL提取液置于10 mL比色管中，按照1.3.8.1 節(jié)方法進(jìn)行操作，于500 nm 波長處測定吸光度，并根據(jù)回歸方程，按照公式（4）計算提取液中原花青素的釋放量（以兒茶素當(dāng)量計）。

式中：ρ1為提取液中原花青素釋放量/（mg/mL）；V1為提取液總體積/mL；m為南酸棗皮樣品質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 南酸棗皮中總多酚的釋放情況

圖1 南酸棗皮總多酚的釋放量Fig.1 Amount of total polyphenols in Choerospondias axillaris fruit peels

由圖1可知，南酸棗皮總多酚在模擬胃、腸液中的釋放呈增加趨勢。在模擬胃液的釋放量為73.72 mg/g；在模擬腸液中消化后釋放量增加10.29 mg/g，在模擬胃液中的釋放量占模擬胃腸液總釋放量的87.75%。可以看出酚類化合物主要在胃部消化釋放。研究發(fā)現(xiàn)，胃、腸道消化環(huán)境較為復(fù)雜，蛋白質(zhì)、碳水化合物等大分子物質(zhì)易與多酚類化合物發(fā)生結(jié)合，形成結(jié)合態(tài)多酚，并且不同的pH值環(huán)境對多酚類化合物影響不同。在胃、腸道消化酶的作用下，結(jié)合態(tài)多酚化合物隨大分子物質(zhì)水解而分離釋放；但胃腸道具有不同的pH值環(huán)境，胃液pH值較低呈強(qiáng)酸性，多酚類化合物在酸性環(huán)境中結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而腸道pH值偏堿性，消化液中的多酚類化合物在該環(huán)境下易發(fā)生聚合或降解，多酚類化合物種類的差異決定了其在消化過程中量變或質(zhì)變的不同[18-22]。

溶劑提取結(jié)果表明，傳統(tǒng)熱水浸提得總多酚釋放量為123.76 mg/g，是超聲波輔助乙醇提取總多酚釋放量的88.62%。模擬胃腸液中的總多酚釋放量顯著低于溶劑提取的總多酚釋放量，分別為傳統(tǒng)熱水浸提和超聲波輔助乙醇提取總多酚釋放量的67.88%、60.16%。由于棗皮中含有豐富的膳食纖維，蛋白酶無法破壞其致密結(jié)構(gòu)，可能對多酚類化合物的釋放具有一定阻礙作用。因此直接食用棗皮無法使其中的多酚類化合物充分釋放出來，使其隨著棗皮殘?jiān)懦鲶w外。熱水浸提是中藥傳統(tǒng)口服給藥形式，它利用高溫促進(jìn)傳質(zhì)過程，增加溶劑的滲透和多酚類化合物的擴(kuò)散，但多酚類化合物在水中的溶解度小于在乙醇中，且高溫長時加熱易造成多酚類化合物降解，故將南酸棗皮以藥用方式浸提仍無法實(shí)現(xiàn)其充分釋放。而超聲波技術(shù)可產(chǎn)生空化效用，通過機(jī)械作用破壞棗皮細(xì)胞壁，增加乙醇的滲透性，從而使多酚類化合物可與乙醇充分融合而溶出，釋放量最高。

2.2 南酸棗皮中總黃酮的釋放情況

圖2 南酸棗皮總黃酮的釋放量Fig.2 Amount of total flavonoids in Choerospondias axillaris fruit peels

由圖2可知，總黃酮的消化釋放與總多酚的變化相似。模擬胃液消化1 h后，南酸棗皮總黃酮的釋放量為38.55 mg/g，模擬腸液消化2 h后釋放量增加8.78 mg/g，增幅為22.79%，在模擬胃液中的釋放量占模擬胃腸液總釋放量的81.44%。與總多酚的變化趨勢不同的是，在模擬腸液中黃酮類化合物釋放量增幅較大，腸道對其影響較明顯。Bouayed等[13]也發(fā)現(xiàn)“Jonaprinz”、“Jonagold”、“Golden”和“Mutzu” 4種蘋果經(jīng)消化后，腸液中的總黃酮釋放量高于胃液中的釋放量。以上結(jié)果可能是由于：1）腸道消化酶有益于黃酮類化合物的釋放，可與南酸棗皮進(jìn)一步作用釋放黃酮類化合物；2）其他非黃酮類化合物在腸道消化酶及pH值環(huán)境的作用下發(fā)生結(jié)構(gòu)重組或降解生成黃酮類化合物[13-14,22]。

傳統(tǒng)熱水浸提所得總黃酮的釋放量為80.26 mg/g，是超聲波輔助化學(xué)提取所得量的85.22%。模擬胃腸液中總黃酮釋放量分別為傳統(tǒng)熱水浸提和超聲輔助化學(xué)提取所得釋放量的58.97%、50.26%。與南酸棗皮中總多酚的釋放量相比，黃酮類化合物在模擬胃腸液中的釋放量較低，與溶劑提取所得釋放量相差較大，溶劑提取更有助于黃酮類化合物的釋放。

2.3 南酸棗皮原花青素的釋放情況

由圖3可知，原花青素在模擬胃、腸液中的釋放與總多酚、總黃酮趨勢不同，呈下降趨勢。經(jīng)傳統(tǒng)熱水浸提后原花青素釋放量為78.61 mg/g，是超聲波輔助乙醇提取所得釋放量的87.56%。模擬胃液消化后，南酸棗皮原花青素釋放量為37.53 mg/g，占超聲波輔助乙醇提取釋放量的41.81%；經(jīng)模擬腸液消化后，釋放量顯著下降，降幅為17.87%，與模擬胃液的釋放量之間存在極顯著差異（P＜0.01)。在模擬腸液中，原花青素的降解易受兩種因素影響：1）與胰蛋白酶、膽鹽相互作用發(fā)生分解；2）pH值的升高會引起二聚體的分解，當(dāng)pH值達(dá)到8時，所有的二聚體消失，降解為單體或轉(zhuǎn)化為其他多酚類化合物[23]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推知，經(jīng)模擬胃液消化后，從南酸棗皮中釋放的原花青素可能由部分高聚物、大量二聚體和少量單體組成，模擬胃液消化促進(jìn)其中原花青素的釋放，其含量增加，隨著消化到達(dá)腸道，南酸棗皮粉繼續(xù)吸水膨脹，空間阻礙減少，在腸道消化酶的作用下仍有部分原花青素釋放，但南酸棗皮中含有較多的二聚體，模擬腸液的pH值在7.0～7.5之間，引起二聚體發(fā)生分解，釋放量小于分解量，從而引起原花青素含量降低。綜合比較總多酚、總黃酮和原花青素的釋放情況發(fā)現(xiàn)胃、腸道消化可促進(jìn)多酚類化合物從棗皮中釋放，對釋放到消化液中的多酚類化合物也有較大影響，引起變化趨勢不同，但三者在胃腸道中的釋放量均小于溶劑提取的釋放量。模擬胃腸液消化對原花青素的釋放作用較小，溶劑提取更有利于原花青素的釋放。比較3種處理方式發(fā)現(xiàn)，超聲波輔助乙醇提取可充分釋放棗皮中的多酚類化合物，熱水浸提其次，模擬胃腸液消化最低，故南酸棗皮中多酚類化合物的釋放順序?yàn)椋夯瘜W(xué)提?。局兴幙诜局苯邮秤?。

圖3 南酸棗皮原花青素的釋放量Fig.3 Amount of proanthocyanidins in Choerospondias axillaris fruit peels

2.4 模擬胃腸液消化各成分的生物利用率

圖4 南酸棗皮的生物利用率Fig.4 Bioavailability of Choerospondias axillaris fruit peels

為了模擬小腸上皮細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收阻礙作用，在體外模擬胃腸液消化實(shí)驗(yàn)中，使用透析袋建立一個簡單的力學(xué)模型來完成營養(yǎng)物質(zhì)的可利用性[24]。由圖4可知，透析袋內(nèi)總多酚、總黃酮和原花青素釋放量分別為5.94、5.48、3.21 mg/g，生物利用率分別為7.07%、11.59%和10.42%，分別占超聲波輔助乙醇提取總量的4.25%、5.23%和3.58%，生物利用率均較低。腸液pH值偏堿性，消化釋放的高含量多酚類化合物進(jìn)入腸道后，在弱堿性和低溫條件下，易分解生成小分子，或相互偶聯(lián)生成大分子物質(zhì)，或與其他原料組分之間聚合形成低溶解度或分子質(zhì)量較大的物質(zhì)，進(jìn)而無法穿過透析袋，導(dǎo)致食品的生物利用率較低[25]。比較以上結(jié)果可以看出，雖然模擬胃腸液消化無法使黃酮類化合物完全釋放，但是其生物利用率卻高于總多酚，因此透析袋內(nèi)以黃酮類化合物為主，可推測出人體對黃酮類化合物有較多吸收。

3 結(jié) 論

體外模擬胃腸液消化發(fā)現(xiàn)，消化過程中消化酶、pH值對南酸棗皮中總多酚、總黃酮、原花青素的釋放有顯著影響。總多酚、總黃酮、原花青素的釋放主要在胃部發(fā)生。模擬胃液可促進(jìn)多酚類化合物的釋放；模擬腸液消化可少量增加總多酚、總黃酮釋放量，其中總黃酮的增幅高于總多酚，但其引起原花青素釋放量的下降。

透析袋具有選擇透過性，根據(jù)其孔徑大小，相對分子質(zhì)量小的物質(zhì)可穿過透析袋，而大分子物質(zhì)則被截留在透析袋外。本實(shí)驗(yàn)通過透析袋來模仿小腸上皮細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收阻礙作用，得出黃酮類化合物最可能被人體吸收利用。

綜合比較3種處理方式發(fā)現(xiàn)，超聲波輔助乙醇提取可充分釋放棗皮中的多酚類化合物，熱水浸提其次，模擬胃腸液消化僅可釋放部分多酚類化合物，故南酸棗皮中多酚類化合物的釋放量排序?yàn)椋夯瘜W(xué)提?。局兴幙诜局苯邮秤?。

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