覃杰 閆翠 陳極鋒 單鴻

干細(xì)胞治療有望治愈心肌梗死和預(yù)防慢性心力衰竭，但倫理、干細(xì)胞來源有限及異體干細(xì)胞免疫排斥等問題尚未解決，阻礙了干細(xì)胞在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用[1-3]。Yeh 等[3]報道脂肪干細(xì)胞(ADSC)可向多種細(xì)胞分化，并能分泌多種細(xì)胞因子。李博等[4]報道ADSC能有效改善心肌梗死后的心功能。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和臍帶血干細(xì)胞等相比，ADSC具有來源廣泛、容易取材、損傷較小、自體移植無免疫排斥、體外增殖速度快優(yōu)勢[3-4]。使用ADSC移植可克服倫理、干細(xì)胞來源有限及異體干細(xì)胞免疫排斥等問題，但單純使用ADSC移植治療心肌梗死，效果欠佳[2-4]。Zhang等[5]報道堿性成纖維生長因子(bFGF)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖，增加新生血管，提高局部血流量。Yao等[6]報道bFGF可提高梗死區(qū)域血管密度，減少心肌梗死面積。少有文獻(xiàn)研究報道bFGF在ADSC治療心肌梗死的作用。為此，本研究使用ADSC及bFGF移植治療心肌梗死，探討bFGF在ADSC治療心肌梗死中的作用。

材料與方法

一、ADSC的分離培養(yǎng)及標(biāo)記

取大鼠腹股溝脂肪組織，以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗碎片及血細(xì)胞。在37℃下用0.1 g/L I型膠原酶(Sigma)消化脂肪組織后離心、過濾、重懸，接種至培養(yǎng)皿培養(yǎng)，3 d后換液，棄除未貼壁細(xì)胞，每隔3 d換液，貼壁細(xì)胞長至90%時，使用胰酶消化傳代，并用PKH26標(biāo)記細(xì)胞。

二、流式細(xì)胞分析

使用 PE標(biāo)記的抗大鼠 CD29(Biolegend)、FITC標(biāo)記的 CD90(Biolegend)、FITC標(biāo)記的CD45(Biolegend)以及PE標(biāo)記的CD34(Santa Cruz)抗體進(jìn)行流式細(xì)胞分析。4℃恒溫避光孵育30 min后，PBS沖洗2次，離心棄上清液。用10 g/L多聚甲醛(PFA)溶液固定，設(shè)同型對照，4 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀(FACS)檢測。

三、ADSC的分化潛能鑒定

成脂誘導(dǎo):1.0×105細(xì)胞/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度大于90%后，加入含100 ml/L胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、5 μg/ml胰島素的H-DMEM成脂誘導(dǎo)液，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d更換新鮮誘導(dǎo)液。誘導(dǎo)分化20 d后棄成脂誘導(dǎo)液，PBS洗3次，1 g/L中性甲醛室溫固定1 h，PBS清洗后加入油紅O染色1 h，蒸餾水沖洗，顯微鏡(×400)下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成情況。

成骨誘導(dǎo):以1.0×105細(xì)胞/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中。當(dāng)細(xì)胞長至80%融合時，將培養(yǎng)基更換為含100 ml/L胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、50 μg/ml維生素 C、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉的成骨誘導(dǎo)液，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 d更換新鮮誘導(dǎo)液。誘導(dǎo)分化第14日吸去成骨誘導(dǎo)液，室溫下用1 g/L中性甲醛固定30 min，PBS清洗后加入茜素紅(pH=4)滴染3～5 min，顯微鏡(×400)下觀察鈣結(jié)節(jié)的形成情況。

四、心肌梗死模型與細(xì)胞移植

65只SD大鼠由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。本研究經(jīng)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。用戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，使用容量可調(diào)的動物呼吸機(jī)輔助呼吸。打開胸廓后，剪開心包，用6-0聚丙烯縫線在距起源2～3 mm的位置結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)。結(jié)扎成功時LAD供血部位(左心室前壁)立即變白，搏動減弱，心電圖示ST-T段弓背抬高。心肌梗死造模1周后，死亡5只，將剩余60只大鼠隨機(jī)分成4組(PBS組、bFGF組、ADSC組和ADSC+bFGF組)，每組15只。PBS組單純注射PBS，bFGF組單純注射bFGF，ADSC組注射含4×106ADSC懸液，ADSC+bFGF組注射含4×106ADSC的bFGF懸液。

五、LVEF檢測及心臟組織學(xué)檢測

心肌梗死后4周用14.0 MHz探頭行大鼠心臟超聲檢查，測量LVEF。

心臟超聲檢查后處死動物，迅速取出心臟凍存于新鮮的OCT冰凍培養(yǎng)基中或者固定于4%多聚甲醛，用于制備冰凍或者石蠟切片。梗死面積計(jì)算:梗死區(qū)的心內(nèi)圓周長/整體心內(nèi)圓周長×100%。每一個標(biāo)本梗死面積為5個代表性切面的梗死面積平均值。

六、免疫熒光與免疫組織化學(xué)染色

組織切片以抗cTnT(Santa Cruz)、抗平滑肌肌動蛋白SMA(美國Sigma)、抗vWAg(丹麥Dako)進(jìn)行免疫染色。免疫組織化學(xué)染色采用DAB顯色法。在Ⅷ因子染色的切片上測量梗死區(qū)微血管數(shù)量:先在100倍鏡下識別梗死區(qū)，后在200倍下計(jì)算血管的數(shù)量。計(jì)算所有管腔中被橫切的血管數(shù)。每一標(biāo)本取5個代表性的切片，每一切片在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)5個代表性視野，取平均值。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、4組心肌梗死大鼠的基本情況

4組大鼠的性別比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.23)，體質(zhì)量比較差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.17)，見表1。

表1 4組心肌梗死大鼠的基本情況

二、ADSC特征及誘導(dǎo)

成功分離ADSC，流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示絕大多數(shù)ADSC表達(dá)CD29和CD90，不表達(dá) CD34和CD45。多向誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示ADSC可分化為脂肪和骨骼。成脂誘導(dǎo)分化20 d后，油紅O染色結(jié)果見成簇脂肪滴形成(圖1A)。成骨誘導(dǎo)分化14 d后，茜素紅染色結(jié)果可見大量骨組織(圖1B)。

圖1 ADSC成脂及成骨誘導(dǎo)分化(×400)

三、4組心肌梗死大鼠的LVEF比較

4組 LVEF比較有差異(F=146.45，P＜0.01)。其中，ADSC+bFGF組及ADSC組的LVEF高于PBS組和bFGF組(P＜0.01)，ADSC+bFGF組的LVEF高于ADSC組(P＜0.01)，PBS組和bFGF組的LVEF比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.33)，見圖2。

四、4組大鼠的心肌梗死面積比較

4組心肌梗死面積比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=114.56，P＜0.01)。其中，ADSC+bFGF組及ADSC組的心肌梗死面積小于PBS組和bFGF組(P＜0.01)，ADSC+bFGF組的心肌梗死面積小于ADSC組(P＜0.01)，PBS組和bFGF組的心肌梗死面積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.28)(圖3AE)。

圖2 各組心肌梗死大鼠的LVEF比較

五、ADSC分化

ADSC移植4周后，組織切片免疫熒光染色顯示在注射部位出現(xiàn)PKH26陽性且SMA陽性、cTnT陽性和vWAg陽性細(xì)胞。

六、各組大鼠梗死部位新生血管比較

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示新生毛細(xì)血管數(shù)量由多到少依次為 ADSC+bFGF組 [(235.26±24.12)個/mm2]、ADSC組 [(176.28±20.22)個/mm2]、bFGF組 [(118.60±21.46)個/mm2]及PBS組 [(64.58±18.88)個/mm2]，見圖4AD。各組大鼠新生血管密度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=519.20，P＜0.01)，見圖4E。

討 論

為了更有效地治療心肌梗死，國內(nèi)外研究人員在初期的動物實(shí)驗(yàn)中利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞及臍帶血干細(xì)胞等治療心肌梗死取得了較好的成績，并進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[2-5]。本研究結(jié)果顯示大鼠ADSC可成功誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞，說明ADSC具有多項(xiàng)分化潛能，與文獻(xiàn)報道一致[3-4]。因此，本研究采用ADSC可解決倫理、干細(xì)胞來源有限及異體干細(xì)胞免疫排斥等問題。

圖3 各組大鼠的心臟大體標(biāo)本及梗死面積比較

圖4 各組心肌梗死大鼠新生毛細(xì)血管數(shù)量比較

雖然早期動物實(shí)驗(yàn)顯示干細(xì)胞治療可提高左心功能，但近期 Naumova等[7]在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞移植后LVEF略有增加的主要原因是旁分泌作用，而不是干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，因?yàn)橹挥猩儆?.5%的胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞。我們前期動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞未能明顯提高LVEF，干細(xì)胞在7 d內(nèi)大量死亡。REPAIRAMI及BOOST試驗(yàn)等大型隨機(jī)對照實(shí)驗(yàn)顯示在短期及12～18個月隨訪中干細(xì)胞移植均未能明顯改善心功能、減少梗死面積和瘢痕組織重塑[8-9]。

干細(xì)胞治療心肌梗死療效低于預(yù)期的原因較多，常見的有宿主炎癥反應(yīng)、機(jī)械損傷、適應(yīng)不良、缺血或缺血再灌注損傷、細(xì)胞凋亡等[8-10]。Yao等[6]報道bFGF可提高梗死區(qū)域血管密度，減少心肌梗死面積。在4組大鼠的基本條件一致的基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)ADSC+bFGF組及ADSC組的LVEF高于PBS組和bFGF組，ADSC+bFGF組的LVEF高于ADSC組，PBS組和bFGF組的LVEF比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果說明bFGF能促進(jìn)ADSC改善心功能，而單純bFGF并未能改善心臟功能。此外，ADSC+bFGF組心肌梗死面積最小，提示bFGF能促進(jìn)ADSC縮小梗死面積，改善心功能。

為了探討bFGF在ADSC治療心肌梗死中的作用及機(jī)制，我們在ADSC移植4周后取大鼠心臟做免疫組織熒光染色及Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色。免疫組織熒光染色顯示在注射部位出現(xiàn)PKH26陽性且SMA陽性、cTnT陽性和vWAg陽性細(xì)胞，說明ADSC可分化成心肌細(xì)胞、小血管以及血管內(nèi)皮細(xì)胞。Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，毛細(xì)血管數(shù)量由多高到少依次為ADSC+bFGF組、ADSC組、bFGF組及PBS組，各組間新生血管密度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明bFGF能促進(jìn)ADSC分化為新生毛細(xì)血管，改善心肌梗死部位的供血，提高移植細(xì)胞存活，促進(jìn)心肌梗死愈合，縮小梗死面積，提高心功能。

綜上所述，bFGF能夠促進(jìn)ADSC分化為心肌細(xì)胞和新生毛細(xì)血管，改善心功能，有望促進(jìn)干細(xì)胞治療心肌梗死在臨床的應(yīng)用。

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