青蒿素結(jié)構(gòu)研究協(xié)助組

張東1，楊嵐1，王滿元2，屠呦呦

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700；2.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京10006）

HPLC-ELSD測(cè)定青蒿素片中青蒿素的含量

青蒿素結(jié)構(gòu)研究協(xié)助組

張東1，楊嵐1，王滿元2，屠呦呦

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京100700；2.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京10006）

青蒿素是從青蒿中提取出來的有效成分，是我國(guó)唯一獲得國(guó)際承認(rèn)的抗瘧藥物。青蒿素片是由我所研制，該藥對(duì)間日瘧、惡瘧包括兇險(xiǎn)型腦瘧均有卓效，尤其對(duì)抗氯喹、抗喹哌等抗性瘧疾有特效。青蒿素的含量測(cè)定方法一般采用雙波長(zhǎng)薄層掃描法、紫外分光光度法[1]、柱前衍生-RP-HPLC[2]、高效液相蒸發(fā)光散射檢測(cè)法[3]、反相高效液相色譜法[4]等。目前青蒿素片的含測(cè)方法為紫外分光光度法，該法有干擾，不準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定青蒿素片中青蒿素的含量，方法可靠，結(jié)果準(zhǔn)確，可以控制青蒿素片的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Alliance高效液相色譜儀及Empower2色譜工作站（Waters公司）；2420蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Waters公司）；NA-5L氮?dú)獍l(fā)生器（北京中興匯利科技發(fā)展有限公司）；KQ-100型超聲波清洗器（功率300 W，頻率50 kH、昆山超聲儀器有限公司）；Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；青篙素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度大于98%，批號(hào)100202-200402）；青篙素片（本實(shí)驗(yàn)室自制，批號(hào)為060510，060511，060512），甲醇（色譜純）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ThremoC18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：甲醇-水（80∶20），流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25℃；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度60℃，載氣（N2）壓力5.8×10-3Pa，增益值為50，進(jìn)樣體積為5 μL。

2.2 方法的專屬性考察

由青篙素與溶劑及輔料的HPLC-ELSD色譜圖可知，輔料對(duì)青篙素的測(cè)定沒有干擾，色譜柱的理論塔板數(shù)按青篙素的峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的青篙素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.501 mg的溶液，為對(duì)照品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對(duì)照品溶液2，4，5，6，8 μm注入液相色譜儀，計(jì)算峰面積，以進(jìn)樣量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為：Y=1.8784X+5.9856，r=0.9996。表明對(duì)照品在1.002～4.008 μg內(nèi)，進(jìn)樣量對(duì)數(shù)與峰面積對(duì)數(shù)呈良好線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，以青篙素的含量計(jì)算RSD為1.83%（n=6），表明精密度良好。

2.6 樣品溶液的制備

取本品20片，精密稱定，研細(xì)混勻，精密稱取細(xì)粉適量（相當(dāng)于青篙素50 mg）置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，稱定重量，超聲（300 W，50 kHz）處理15 min放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm濾過），取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份（批號(hào)為060510）腆試品溶液，分別于0，1，2，4，6，24 h測(cè)定，測(cè)得的峰面積變化趨勢(shì)不明顯，以青篙素的含量計(jì)算RSD為0.72%，表明在室溫條件下供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)060510）6份，分別制備成供試品溶液，在所確定的HPLC條件下，測(cè)定青篙素的含量，RSD為1.86%，說明方法重現(xiàn)性良好。

2.9 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量同一批號(hào)的樣品（批號(hào)060510，含量每片248.7 mg）6份，每份約30 mg（含青篙素約24 mg），分別精密加青篙素對(duì)照品適量，精密加甲醇100 mL，按“2.6”方法制成供試品溶液。測(cè)定青篙素的含量，結(jié)果平均回收率為99.45%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.31%，說明方法是可靠的。

2.10 樣品測(cè)定

精密吸取對(duì)照品溶液5 μL，3批樣品溶液5 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算供試品中青篙素的含量。測(cè)定結(jié)果見表1。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇了石油醚、乙酸乙酯、甲醇作為提取溶劑，結(jié)果均能提取完全，但是石油醚和乙酸乙酯極性較小，需要回收溶劑后再以流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣，甲醇不需要回收溶劑，所以選擇甲醇作為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)還考察了提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)超聲15 min就能提取完全，所以選擇超聲15 min。

本實(shí)驗(yàn)選擇了3種不同品牌的色譜柱分別在兩臺(tái)液相色譜儀上對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)果變化很小，RSD為1.26%，說明本方法的耐用性良好。

李燊錦等[4]，采用反相高效液相色譜法測(cè)定青篙素的含量，青篙素測(cè)定的線性范圍為10.4～104 μg對(duì)樣品含量要求較高，對(duì)于微量的青篙素?zé)o法測(cè)量，具有一定的局限性，應(yīng)用本法測(cè)定青篙素的線性范圍為1.002～4.008 μg有效的解決了這個(gè)問題，定量下限降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)。

本實(shí)驗(yàn)所建立的HPLC-ELSD方法測(cè)定青篙素的含量，準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)，靈敏度及穩(wěn)定性均較好，測(cè)定方法可靠，測(cè)定結(jié)果能客觀反映青篙素的含量，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法，并可作為其他復(fù)方制劑的參考。

摘編自《中國(guó)藥學(xué)雜志》，2008年第43卷第7期：491～492頁，圖、表、參考文獻(xiàn)已省略。