周春光，段文彪，趙延榮，李倉，孫克龍，張誼，單云峰，張啟瑜

組織工程和再生醫(yī)學的興起使很多組織壞死性疾病有望得到治療和治愈[1]。干細胞作為組織工程中種子細胞的主要來源，對其在分化上的研究一直是組織工程領域的研究熱點[2-4]。大量研究[5-6]證明VEGF能促進ADSCs及其他干細胞向ECs分化。探索如何尋求有效的途徑使去肝臟細胞化支架再細胞化，以獲得具有不完全肝功能的肝樣組織甚至具有完整血管網(wǎng)絡的再細胞化肝臟一直是肝臟再生醫(yī)學研究者們不懈努力的目標。本研究通過大鼠肝間質(zhì)細胞—大鼠肝星狀細胞與大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞，在內(nèi)皮細胞分化誘導培養(yǎng)基中的間接共培養(yǎng)，觀察在VEGF誘導下，HSCs對rADSCs向ECs分化的影響，為之后兩種細胞在去細胞化支架內(nèi)直接有序的共培養(yǎng)獲取再細胞化肝臟提供研究策略。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠肝卵圓細胞WB-F344購自中科院上海細胞庫；戊巴比妥鈉、IV型膠原酶、Triton X-100購自Sigma公司；PBS購自Hyclone公司；FBS、DMEM/F12、DMEM、0.25% EDTA胰酶購自Gibco公司；vWF一抗、eNOs一抗和VE-Cadherin（CD144）一抗、Donkey Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor?594）熒光二抗、Donkey Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor?488）熒光二抗購自Abcam公司；APC-CD90、Mouse IgG1（κPurified）、Mouse IgG1（κAPC）、Matrigel基質(zhì)膠購自BD Biosciences公司；Goat anti-Mouse IgG H&L-HRP、Goat anti-Rabbit IgG H&L-HRP購自Bioworld公司；Transwell共培養(yǎng)小室購自Corning公司；CCK8試劑盒購自Dojindo公司；ECM培養(yǎng)基購自ScienCell公司；rVEGF購自PeproTECH公司；BCA試劑盒購自Beyotime公司；乙酰化低密度脂蛋白（DiI labeled acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac-LDL）購自YiYuanBiotech公司。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠脂肪間充質(zhì)干細胞（rat adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，rADSCs）的分離和培養(yǎng)：選取6周齡SPF級雄性SD大鼠兩只，2%戊巴比妥鈉0.3 mL/g腹腔注射麻醉，無菌條件于大鼠后腹膜及腎周處取出多塊體積約為1 mL左右的脂肪塊經(jīng)PBS沖洗后置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，迅速轉(zhuǎn)移至超凈臺用無菌眼科剪將脂肪塊剪碎，分別放入15 mL離心管內(nèi)，加入4 mL含有0.075% IV型膠原酶的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37 ℃下震蕩消化60 min，200目無菌篩網(wǎng)過濾消化物，濾液經(jīng)1500 r/min離心10 min收集細胞，用含有15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，以1×105的密度種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1 d后換液。以后每兩天換液一次，待細胞融合至培養(yǎng)瓶底80%時用含0.25%EDTA的胰酶消化傳代。

1.2.2 rADSCs表面標記物的鑒定：取第三代rADSCs，胰酶消化制成單細胞懸液，離心PBS重懸，以每管1×106分裝細胞，用APC直接標記的CD90和IgG H&L Alexa Fluor?488間接標記的CD144（VE-Cadherin）對rADSCs進行表面標記物的鑒定，以Mouse IgG1（κPurified）和Mouse IgG1（κAPC）作同型對照。1.2.3 共培養(yǎng)條件下誘導rADSCs向內(nèi)皮細胞（endothelial cells，ECs）分化：利用膜孔徑0.4μm的Transwell共培養(yǎng)小室，下層以1×104/孔的rADSCs在含有15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，上層分別以1×103、1×104、1×105/孔的HSCs在含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，共培養(yǎng)2 d后，CCK8法測定下層rADSCs活力，選擇rADSCs活力最好的組作為誘導培養(yǎng)的細胞比例。以之前確定的共培養(yǎng)細胞比例在Transwell共培養(yǎng)小室內(nèi)，用內(nèi)皮細胞誘導培養(yǎng)基替換DMEM/F12培養(yǎng)基后誘導rADSCs向ECs分化。內(nèi)皮細胞誘導培養(yǎng)基成分包括：ECM（Endothelial Cell Medium）、5% FBS、pen/strep、ECGS（endothelial cell growth supplement）、10 ng/mL rVEGF。每2 d換一次誘導培養(yǎng)基，重新消化接種特定數(shù)目的HSCs，觀察下層rADSCs誘導7 d和14 d后的形態(tài)學改變。誘導2周后收集各組誘導后的rADSCs，擴增、凍存?zhèn)溆谩９才囵B(yǎng)實驗設置四組，陽性對照組為大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞（rat Brain microvascular en-dothelial cells，rBMVECs）；實驗組為HSCs與rADSCs在內(nèi)皮細胞分化誘導培養(yǎng)基中共培養(yǎng)；陰性對照組為肝卵圓細胞（hepatic oval cells，HOCs）與rADSCs在內(nèi)皮細胞分化誘導培養(yǎng)基中共培養(yǎng)；空白對照組為rADSCs在內(nèi)皮細胞分化誘導培養(yǎng)基中單獨誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)及誘導后所得內(nèi)皮細胞分別記為：陽性對照組，rBMVECs；實驗組，（rADSCs+HSCs）ECs；陰性對照組，（rADSCs+HOSs）ECs；空白對照組，（rADSCs）ECs。

1.2.4vWF、eNOs、VE-Cadherin免疫熒光染色：誘導2周后，用內(nèi)皮細胞特異性標記抗體—vWF、eNOs和VE-Cadherin鑒定誘導后rADSCs的表型。簡要步驟為將已爬好rADSCs細胞的玻片用PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定爬片15 min，0.5% Triton X-100室溫通透20 min，驢血清室溫封閉30 min，加足夠量的稀釋好的一抗在濕盒中4 ℃孵育過夜；第二天用PBS浸洗爬片3次，加稀釋好的熒光二抗（Donkey Anti-Rabbit IgG H&L（Alexa Fluor?594）或Donkey Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor?488，Abcam）在濕盒中37 ℃孵育1 h，滴加DAPI避光孵育5 min進行核染，PBS洗去多余的DAPI，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.5eNOs蛋白表達檢測：取誘導2周后的rADSCs細胞，提取細胞蛋白；BCA試劑盒測蛋白濃度，計算上樣量；制8%和10%的SDS-PAGE膠，以60 mv跑膠，至樣品進入分離膠后改為110 mv恒壓電泳；以350 mA恒流轉(zhuǎn)膜80～120 min；用5%脫脂奶粉封閉1 h，加稀釋好的一抗（vWF、eNOs和VE-Cadherin）在濕盒中4 ℃孵育過夜，TBST洗三次后，加5%脫脂奶粉配制好的二抗（Goat anti-Mouse IgG H&L-HRP和Goat anti-Rabbit IgG H&L-HRP），常溫孵育1 h后，于暗室中加發(fā)光劑發(fā)光、曝光。

1.2.6 功能學檢測

（1）細胞遷移試驗：取誘導2周后的rADSCs細胞，用無血清ECM培養(yǎng)基重懸細胞，在膜孔徑8μm的Transwell小室（Corning）上層加入200μL細胞懸液（細胞濃度1×105/mL），在小室下層加入600μL含5% FBS和20 ng/mL rVEGF的ECM養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出上層小室，用干凈的棉簽輕輕拭去小室底部膜上層的細胞，最后把小室底部的膜輕輕取下，并把膜的底面朝上，用4%多聚甲醛固定15 min后，DAPI染色5 min，在熒光顯微鏡下觀察穿過膜的細胞。

（2）DiI-Ac-LDL吞噬試驗：誘導2周后在小室下層的誘導培養(yǎng)基中加入25μg/mL乙?；兔芏戎鞍祝―iI labeled acetylated low-density lipoprotein，DiI-Ac-LDL），37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后用PBS清洗細胞3次，用4%多聚甲醛固定15 min，DAPI染色5 min，在熒光顯微鏡下觀察細胞DiI-Ac-LDL的吞噬情況。

（3）體外成血管試驗：取誘導2周后的rADSCs細胞，用無血清ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，用誘導培養(yǎng)基制成細胞懸液，以1×105/孔加入到鋪有Matrigel基質(zhì)膠的24孔板中，置于37 ℃、5% C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察細胞成血管情況。

1.2.7 統(tǒng)計學分析：用統(tǒng)計軟件SPSSl9.0進行統(tǒng)計分析，計量資料用（±s），多組間差異比較采用單因素方差分析TuKey HSD方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 原代rADSCs的表面標記物鑒定

由大鼠脂肪組織提取的原代rADSCs經(jīng)過傳代培養(yǎng)后逐漸純化，流式細胞技術檢測結(jié)果（圖1）顯示第3代rADSCs表面標記物CD90陽性率達96.0%，CD144陰性率達93.1%。

2.2 共培養(yǎng)誘導體系初始細胞比例的確定

圖1 rADSCs細胞表型分析

共培養(yǎng)體系中各種細胞比例對目的細胞的生長增殖有重大影響，因此確定最優(yōu)的共培養(yǎng)初始細胞比例是十分必要的。我們分別以1×103、1×104、1×105/孔的HSCs和1×104/孔的rADSCs進行最優(yōu)共培養(yǎng)初始細胞比例的探索，誘導培養(yǎng)2d后測定下層rADSCs細胞數(shù)，結(jié)果（圖2）顯示在HSCs為1×104/孔時，下層rADSCs生長相對最好（P＜0.05）。配合光鏡下對細胞形態(tài)的觀察，我們確定以1×104/孔HSCs和1×104/孔rADSCs作為共培養(yǎng)誘導體系初始細胞比例。注意到所用HSC-T6的增殖速率明顯高于原代提取的rADSCs，當上層HSCs細胞量過高時（以1×105/孔培養(yǎng)2 d后），共培養(yǎng)體系中營養(yǎng)消耗過快，影響下層rADSCs生長，我們確定每兩天換一次誘導培養(yǎng)基，重新消化接種特定數(shù)目的HSCs。

2.3 rADSCs誘導后形態(tài)學的變化

原代提取的rADSCs呈梭形或多邊形，細胞融合至70%～90%后呈旋渦狀生長。誘導后的rADSCs形態(tài)逐漸變短變圓，隨著誘導時間的延長，越來越多的細胞出現(xiàn)內(nèi)皮細胞典型的鵝卵石樣改變。

圖2 共培養(yǎng)誘導培養(yǎng)2 d后3種共培養(yǎng)體系rADSCs生長情況比較（*P＜0.05）

2.4 誘導后rADSCs免疫學指標的變化

圖3HSCs共培養(yǎng)誘導第0、7和14天rADSCs光鏡下細胞形態(tài)（×100）

圖4 誘導2周后各組細胞vWF和VE-Cadherin免疫熒光雙染，DAPI染核（藍色），rBMVECs為陽性對照（×200）

圖5 誘導2周后各組細胞eNOS和VE-Cadherin免疫熒光雙染，DAPI染核（藍色），rBMVECs為陽性對照（×200）

免疫熒光檢測結(jié)果（圖4、5）顯示，四組細胞vWF和VE-Cadherin表達均陽性；陽性對照組和實驗組eNOS表達強陽性，陰性對照組和空白對照組eNOS表達弱陽性。Western blotting檢測結(jié)果（圖6、7）與免疫熒光結(jié)果一致，實驗組eNOS蛋白表達（0.71±0.06）明顯高于陰性對照組（0.39±0.07）和空白對照組（0.44±0.05）（P＜0.05），eNOS/GAPDH灰度比值如圖6所示。

圖6 誘導2周后各組細胞eNOS蛋白表達情況，rBMVECs為陽性對照

2.5rADSCs誘導后功能學指標的變化

圖7 誘導2周后各組細胞eNOS/GAPDH灰度比值，rBMVECs為陽性對照（*P＜0.05）

2.5.1 細胞遷移試驗：正常的內(nèi)皮細胞在趨化因子的作用下會顯示出其定向遷移的能力。我們以FBS和VEGF作為趨化因子，檢測誘導所得ECs的定向遷移能力。結(jié)果（圖8、9）顯示，四組細胞在FBS和VEGF作用下均可以在Transwell小室內(nèi)發(fā)生透膜遷移，實驗組每視野下細胞遷移數(shù)目（28.50±3.10）明顯高于陰性對照組（16.25±2.06）和空白對照組（16.50±1.73）（P＜0.01）。

圖8 誘導2周后各組細胞透膜遷移情況，以DAPI染核（藍色）記數(shù)透膜細胞，rBMVECs為陽性對照（×200）

圖9 誘導2周后各組細胞透膜遷移能力比較，rBMVECs為陽性對照（**P＜0.01）

2.5.2 DiI-Ac-LDL吞噬試驗：對DiI-Ac-LDL的吞噬能力是內(nèi)皮細胞具有的特性之一，通過檢測誘導所得ECs對DiI-Ac-LDL的吞噬能力，可以反映內(nèi)皮細胞的成熟程度和功能狀態(tài)。實驗結(jié)果經(jīng)IPP軟件處理測量后，以每視野下IOD（integrated optical density，積分光密度值）反映細胞對DiI-Ac-LDL的吞噬能力。結(jié)果顯示（圖10、11），四組細胞均能不同程度的吞噬DiI-Ac-LDL，實驗組細胞（7383.00±1779.81）吞噬DiI-Ac-LDL的能力明顯高于空白對照組（3337.25±617.14）（P＜0.05）。

2.5.3 體外成血管試驗：成熟的內(nèi)皮細胞具有在Matrigel膠上形成血管網(wǎng)絡的特性，我們將誘導所得的ECs加入到鋪有Matrigel基質(zhì)膠的24孔板中，觀察其成血管的能力。實驗結(jié)果經(jīng)IPP軟件處理測量后，以每視野下小管總長度（像素）反映細胞的成血管能力。結(jié)果顯示（圖12、13），四組細胞均能形成血管樣網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，實驗組細胞（5476.25±826.03）體外成血管的能力明顯高于其他三組細胞—陽性對照組（4153.5±547.16）（P＜0.05）、陰性對照組（3534.25±343.42）和空白對照組（4181.18±948.88）（P＜0.01）。

圖10 誘導2周后各組細胞DiI-Ac-LDL（紅色）吞噬情況，DAPI染核（藍色），rBMVECs為陽性對照（×200）

圖11 誘導2周后各組細胞DiI-Ac-LDL吞噬能力比較，rBMVECs為陽性對照（*P＜0.05）

3 討論

組織工程技術被認為是最終能解決器官衰竭的途徑。然而，功能性組織器官及其生物模擬物的設計和創(chuàng)造，特別是像肝臟這種具有復雜生物學功能的巨大實質(zhì)性臟器，是一個十分復雜的過程。組織工程支架的內(nèi)皮化和血管化是構(gòu)建需要血液灌注的實質(zhì)性臟器的必要環(huán)節(jié)。Basak E等[7]利用內(nèi)皮細胞和肝細胞再細胞化大鼠去細胞化肝臟支架獲得了具有一定肝臟功能的大鼠再細胞化肝臟，并成功將得到的肝臟移植回大鼠體內(nèi)。然而內(nèi)皮細胞并不容易獲得，而ADSCs來源豐富，容易采集，不存在倫理爭議[8]，大量研究[9-10]顯示，ADSCs能在特定條件下向多種成熟細胞分化，包括內(nèi)皮細胞、肝細胞系等。ADSCs已經(jīng)被眾多學者作為種子細胞應用于再生醫(yī)學的研究，Nuness等[11]成功利用脂肪來源的血管基質(zhì)細胞（adipose-de-rived SVF cells）和HepG2細胞系[hepatocyte cell line（HepG2）]設計出具有功能的血管化肝臟組織模擬物，雖然Nunes等認為他們的SVFs在表型上與其他人報道[9，12]的ADSCs有所差異，但他們的研究結(jié)果均證明ADSCs在向內(nèi)皮分化和促進組織血管化方面均有巨大的潛能，這為ADSCs在組織工程方面的應用提供了巨大的可能。因此我們選擇rADSCs進行肝臟組織器官內(nèi)皮化和血管化的研究，我們的實驗結(jié)果再次證明rADSCs在VEGF的誘導下能向內(nèi)皮細胞分化，并表現(xiàn)出成熟內(nèi)皮細胞的表型和功能。

圖12 誘導2周后各組細胞成血管情況，rBMVECs為陽性對照（×100）

圖13 誘導2周后各組細胞成血管能力比較，rBMVECs為陽性對照（*P＜0.05，**P＜0.01）

肝臟完整功能的行使關鍵在于肝臟的完整結(jié)構(gòu)和完整的細胞成分。因此在構(gòu)建功能性肝臟組織器官及其生物模擬物時，多細胞組織器官的多向分化誘導或者共培養(yǎng)便成為必須實現(xiàn)的一步。研究顯示HSCs與肝細胞共培養(yǎng)能促進促進肝細胞形成類肝組織球狀體，并且形成內(nèi)皮化管腔。Abu-Absi等[13]在3D培養(yǎng)基中利用HSC-T6和肝細胞直接共培養(yǎng)模擬肝臟組織再生過程，獲得的類肝組織球狀體具有白蛋白分泌功能，并且具有內(nèi)皮化管道。Kasuya等[14-15]在（D，L-lactide-co-glycolide）PLGA多聚微孔膜上利用小肝細胞（SHs）-肝星狀細胞（HSCs）-內(nèi)皮細胞（ECs）進行3D培養(yǎng)以獲得具有功能的血管化肝臟組織，他們發(fā)現(xiàn)HSCs能促進ECs形成毛細血管樣結(jié)構(gòu)，并增強SHs的肝細胞樣功能。細胞共培養(yǎng)對rADSCs細胞的分化成熟也有重要作用。Zhao等[9]認為ADSCs與成熟細胞的共培養(yǎng)能促進和增強ADSCs的定向分化。我們利用HSCs與rADSCs的間接共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在VEGF誘導下的HSCs可以促進rADSCs向ECs分化，并增強分化后ECs的細胞功能，特別是成血管能力的增強。另外，我們發(fā)現(xiàn)與實質(zhì)性細胞（HOC，肝卵圓細胞-肝臟實質(zhì)性細胞的一種）相比，非實質(zhì)性細胞（HSCs-肝臟非實質(zhì)性細胞的一種）更能促進rADSCs向ECs分化和分化后ECs功能的成熟。

比起細胞直接接觸共培養(yǎng)獲得功能性、血管化肝臟組織類似物，利用Transwell小室進行rADSCs和HSCs的間接共培養(yǎng)的一個優(yōu)點便是能更加容易控制共培養(yǎng)體系中HSCs的細胞比例，從而能更加方便準確的觀察測定在共培養(yǎng)過程中，rADSCs發(fā)生的生物學改變，闡明共培養(yǎng)條件下rADSCs發(fā)生相應改變的可能機制。在生物形態(tài)發(fā)生上，Durdu S[16]等認為很多細胞，如上皮細胞和胚胎干細胞，都具有自發(fā)形成多細胞中央腔的特性，在這個中央腔形成的微環(huán)境中，細胞間的信號交流變得更加高效，中央腔周圍的細胞聯(lián)系得更加緊密，這在對多細胞生物組織器官的發(fā)生和形成過程中具有重要作用。生物形態(tài)發(fā)生機制的逐漸闡明為組織工程的發(fā)展提供了強大的動力。在逐步認識細胞間相互作用促進組織器官形態(tài)發(fā)生的基礎上，以去細胞化肝臟支架為平臺，模擬器官發(fā)生形成過程，利用干細胞、非實質(zhì)性細胞、細胞因子等，以細胞因子包埋或非實質(zhì)性細胞填充構(gòu)建合適的局部微環(huán)境，對干細胞進行程序化灌注，多向誘導分化共培養(yǎng)，最終獲得功能性，血管內(nèi)皮化，可移植利用的組織工程肝臟將成為一種新的、值得嘗試的肝臟組織器官重建策略。

在血管化、可移植組織工程肝臟的構(gòu)建上，Basak團隊取得了巨大的突破，Nunes等對簡單獲取血管化肝臟類似物的研究同樣令人鼓舞，但是現(xiàn)在所能得到的實驗性組織工程肝臟及其類似物遠未能進行臨床試用。去細胞化支架的內(nèi)皮化、多細胞共培養(yǎng)、干細胞的定向多向誘導分化以及之后對組織工程肝臟的神經(jīng)支配系統(tǒng)的研究仍然需經(jīng)歷長期的探索。

綜上所述，通過細胞間接共培養(yǎng)，在VEGF的介導下，HSCs可以促進rADSCs向ECs分化，增強分化后ECs的內(nèi)皮細胞功能。通過對多種細胞，特別是非實質(zhì)性細胞和干細胞，共培養(yǎng)體系深入的研究，可以為功能性血管化組織器官及其生物模擬物的設計和創(chuàng)造提供更加可靠的理論指導和更加廣闊的研究策略。

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