段文彪，高勝強，周春光，趙延榮，李倉，孫克龍，單云峰，張啟瑜

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325000）

肝卵圓細胞（hepatic oval cell，HOC）是一種具有多向分化潛能的肝臟干細胞，能夠分化為成熟肝細胞、膽管上皮細胞等，在一些人肝臟疾病的肝組織中均發(fā)現(xiàn)HOC增生，且增殖數(shù)量與肝病嚴重程度相關(guān)[1-2]。肝卵圓細胞的臨床應用需要解決的關(guān)鍵問題是闡明卵圓細胞活化、增殖和按特定的分化途徑分化的調(diào)控機制。自噬（autophagy）是將細胞內(nèi)受損、變性或者衰老的蛋白質(zhì)以及受損細胞運輸?shù)饺苊阁w進行消化降解的過程，是細胞應對營養(yǎng)缺乏、細胞密度負荷、低氧、氧化應激、感染等惡劣環(huán)境的生存方式之一[3]。自噬作為細胞保持穩(wěn)定狀態(tài)的管家機制，可調(diào)控長壽蛋白、過氧化物酶體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的更新；自噬還可作為一種防御機制，清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細胞器、代謝產(chǎn)物，進行亞細胞水平上的重構(gòu)，保護受損的細胞[4]。缺血缺氧能否誘導肝卵圓細胞自噬以及自噬對肝卵圓細胞在缺血缺氧環(huán)境中是否有保護作用還鮮有報道，本研究對此進行了探討。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠肝干細胞系（卵圓細胞）WB-F344購自中科院上海細胞庫；氯喹（Chloroquine，CQ）、丹（磺）酰戊二胺（Monodansylcadaverine，MDC）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β（LC3B）蛋白多克隆抗體、兔抗鼠βactin單克隆抗體和羊抗兔IgG（H+L）HRP（美國Sigma公司）；DMSO（北京索萊寶公司）；CCK-8（日本同仁化學公司）；胎牛血清、1640培養(yǎng)液、PBS（GIBCO公司）；全自動酶標儀（Bio-2 Rad公司）；DM4000 B LED熒光正置顯微鏡（德國Leica公司）。密封培養(yǎng)罐、AnaeroPack（安寧包）產(chǎn)氣袋和氧氣指示劑（日本三菱瓦斯化學株式會社）；Hoechst33258染色液、BCA法蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：大鼠肝卵圓細胞WB-F344接種于含1%青鏈霉素、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁生長至對數(shù)生長期后，細胞計數(shù)后置入缺血缺氧微環(huán)境中進行試驗。

1.2.2 缺血缺氧模型建立：將肝卵圓細胞接種于培養(yǎng)皿，當細胞密度達到80%～90%時，換成無血清1640培養(yǎng)基，放入密封培養(yǎng)罐后迅速放入安寧包產(chǎn)氣袋一袋和氧氣指示劑一枚，密封，45 min后開始計時。

1.2.3 細胞增殖檢測：采用CCK-8法。取細胞密度為8×104/L 100μL細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。棄舊培養(yǎng)液后實驗組加入100μL無血清1640培養(yǎng)液，對照組加入100μL 10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，按上述分組及實驗處理后；每孔加入10μL CCK-8后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、2 h后于酶標儀450 nm波長處分別檢測各孔吸光度（OD值），細胞生存率=（實驗組OD值-調(diào)零組OD值）/（對照組OD值-調(diào)零組OD值）×100%。

1.2.4MDC熒光染色：取細胞爬片，移去培養(yǎng)液，PBS洗2次，重新加入含有50μmol/LMDC的培養(yǎng)基在37℃孵育1 h后，棄培養(yǎng)基，PBS洗三遍，抗熒光淬滅劑于載玻片上封片，置于DM 4000 B LED熒光正置顯微鏡上，用380 nm波長的激發(fā)光525 nm波長的發(fā)射光濾光片進行觀察。

1.2.5 細胞免疫熒光：取細胞爬片，PBS洗3遍，4%預冷的多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次；0.2% Triton X-100通透10 min，PBS洗3遍；血清封閉30 min，PBS洗3次；加一抗，4 ℃過夜，PBS洗3次；加二抗，37 ℃濕盒內(nèi)1 h，PBS洗3次，甘油封片，熒光下拍片。

1.2.6 蛋白免疫印跡：提取細胞蛋白后，BCA試劑盒測蛋白濃度，20μL總蛋白，12%的SDS-PAGE電泳，切膠，以350 mA恒流濕轉(zhuǎn)膜70 min；5%脫脂奶粉封閉90 min，分別加LC3B、β-actin一抗（均為1:500）4 ℃孵育過夜，37 ℃復溫30 min，TBST洗三次，加5%脫脂奶粉配制二抗（1:5000），常溫下孵育90 min后，TBST洗3次，暗室中ECL發(fā)光、曝光。

1.2.7Hoechst 33258染色：取細胞爬片，棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗兩次，Hoechst 33258染色5 min，PBS洗兩次，滴加抗熒光淬滅劑于載玻片上封片，熒光顯微鏡觀察，并隨機選取視野拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1CCK-8法檢測WB-F344細胞在缺血缺氧中的存活率

結(jié)果顯示，從2 h開始，與對照組比較細胞存活率差異皆有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。隨著缺血缺氧時間的延長，細胞的存活率明顯降低。相同缺血缺氧時間段內(nèi)，加入氯喹與未加氯喹相比，細胞存活率顯著降低（P＜0.05，表1）。

2.2 細胞免疫熒光檢測

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）是酵母Atg8的同源體，調(diào)控微管蛋白的組裝和去組裝，參與自噬體形成，主要在自噬體表達，與對照組相比，隨著缺血缺氧的時間的延長，肝卵圓細胞胞漿LC3表達量顯著上升（圖1）。

表1 抑制自噬前后HOC在缺血缺氧中的存活率（%）

2.3 Western blotting檢測結(jié)果

LC3是檢測自噬現(xiàn)象的特異性標記分子，LC3-II/LC3-I反映自噬程度。Western blotting觀察到，相對于對照細胞，缺血缺氧作用細胞后LC3-II與LC3-I的比值和LC3-II的表達都顯著增加（圖2）。

2.4 MDC染色熒光檢測自噬變化

MDC是一種相對特異性自噬標記物，它可被細胞吸收并選擇性地聚集于自噬體中[4]。激光共聚焦顯微鏡觀察到染上MDC熒光的自噬體呈點狀結(jié)構(gòu)，散布于胞漿及核周，因此可根據(jù)細胞內(nèi)熒光顆粒的變化來推斷自噬的活化。HOC加入自噬抑制劑前后進行不同時間的缺血缺氧，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，缺血缺氧誘導大量熒光顆粒分布于肝卵圓細胞胞漿及核周，顯著高于正常對照細胞。重復試驗三次，每次觀察100個細胞，單純?nèi)毖毖踅MMDC陽性細胞計數(shù)其百分率高于對缺血缺氧+氯喹組（P＜0.05）。

圖1 缺血缺氧后不同時間LC3的細胞免疫熒光染色結(jié)果（×400）

A圖 LC3-I、LC3-II蛋白表達

圖2 缺血缺氧后不同時間LC3-II、LC3-I蛋白表達（A圖）及LC3-II/LC3-I比率變化（B圖）情況

2.5Hoechst 33258染色觀察抑制自噬前后細胞凋亡

隨著缺血缺氧時間延長凋亡細胞增加。缺血缺氧處理相同時間比較，抑制自噬后比抑制前凋亡細胞明顯增多，凋亡特征更明顯。

3 討論

肝卵圓細胞是肝內(nèi)的干/祖細胞，兼具干細胞、肝細胞和膽管上皮細胞的許多表型特點，具有多向分化潛能，與肝臟的再生和腫瘤形成密切聯(lián)系[5]。由于肝卵圓細胞具備體外自我復制、克隆增殖及分化為肝細胞的能力，并可進行體外基因修飾，因此其為肝衰或肝病時細胞移植、組織工程和基因治療帶來新的希望。肝卵圓細胞的臨床應用需要解決的關(guān)鍵問題是闡明卵圓細胞活化、增殖和按特定的分化途徑分化的調(diào)控機制。自噬是細胞應對營養(yǎng)缺乏、細胞密度負荷、低氧、氧化應激、感染等惡劣環(huán)境因素的生存機制之一[3]。研究自噬在肝卵圓細胞活化和增殖中的作用，以及肝卵圓細胞通過自噬適應微環(huán)境的分子調(diào)控機制，對于深入理解肝卵圓細胞參與肝再生、肝癌的發(fā)生以及肝卵圓細胞臨床運用等均具有重要意義。

圖3 自噬抑制前后MDC陽性細胞數(shù)變化情況

自噬（autophagy）最早是由Ashford和Porten在人的肝細胞中觀察到的[6-7]，又稱為II型程序性細胞死亡，是真核細胞通過溶酶體降解其自身的細胞質(zhì)和細胞器，實行“自我消化”的一系列生化過程[8]。在這個過程中，首先是細胞質(zhì)和細胞器被雙層膜包裹形成自噬泡，然后再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最終使被包裹的細胞質(zhì)和細胞器降解[9]。Hourdry于1977年在即將死亡的細胞中發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象，提出自噬能促進細胞存活。自噬對于細胞的合成與降解的作用，在維持細胞的穩(wěn)態(tài)方面有著重要的意義[3]。當機體或細胞處于饑餓，能量缺失等不利狀態(tài)時，自噬體降解機體長壽蛋白或殘存的細胞器，轉(zhuǎn)換為基本氨基酸提供能量，維持機體或細胞的生存[10]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）是自噬體標志蛋白中比較重要的一種，參與自噬體形成過程并占有重要地位。其前體可在自噬過程啟動時被加工成可溶性LC3，后經(jīng)Atg3和Atg7活化修飾，變?yōu)榻Y(jié)合式LC3-II，當自噬體形成后，LC3-I和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）偶聯(lián)形成LC3-II并定位于自噬體內(nèi)膜和外膜。與其他一些定位于自噬性結(jié)構(gòu)膜上的Atg蛋白不同，與溶酶體融合前LC3-II始終穩(wěn)定地保留在自噬體膜上，因此被用來作為自噬體的標記，因此LC3蛋白可作為反映自噬水平的標記物[11]，且LC3-II的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量[12]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β（LC3B）作為LC3蛋白中的一種，其含量也可反映細胞自噬水平的強弱，在自噬形成中，LC3-I與LC3-II/LC3-I比例與自噬體數(shù)量有關(guān)[13]。

盡管己有國內(nèi)外許多研究發(fā)現(xiàn)能夠誘導組織細胞發(fā)生自噬的誘導因素，但關(guān)于缺血缺氧能否誘導肝卵圓細胞自噬鮮有文獻報道。本研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧環(huán)境能夠激活肝卵原細胞自噬程序，主要觀察到以下三點：（1）缺血缺氧體外微環(huán)境能夠誘導干卵圓細胞自噬標志蛋白LC3表達上調(diào)；（2）MDC熒光染色顯示，缺血缺氧誘導大量熒光顆粒分布于肝卵圓細胞胞漿及核周，顯著高于正常對照細胞；（3）CQ可以通過抑制溶酶體的酸化而阻斷自噬作用[14]，加入CQ后MDC染色陽性細胞數(shù)與正常對照組相比以及與單純?nèi)毖毖跸嗤瑫r間相比增加不明顯（P＞0.05)。

圖4Hoechst 33258染色觀察抑制自噬前后細胞凋亡（×400）

本實驗成功構(gòu)建了肝卵圓細胞缺血缺氧模型，實驗結(jié)果顯示缺血缺氧不同時間可以誘導HOC自噬的大量產(chǎn)生，8 h自噬顯著增強。氯喹作為一種靶向溶酶體的藥物，可通過改變?nèi)苊阁w內(nèi)的pH值影響自噬溶酶體對包裹蛋白質(zhì)的降解，抑制磷脂酶A2、溶血磷脂?；饷敢约皢熙；视椭久富钚裕瑥亩种扑嵝砸蕾囆宰允勺饔?，導致自噬體內(nèi)物質(zhì)不能被溶酶體降解而引起自噬性囊泡在細胞內(nèi)堆積，溶酶體膜通透性改變使溶酶體腫脹、破裂而致細胞死亡，從而阻斷自噬的最后一步[14-15]。應用CQ特異的抑制自噬，肝卵原細胞缺血缺氧后，自噬減少，HOC存活率顯著降低，凋亡增加，凋亡特征更明顯。因此，我們推測缺血缺氧誘導的自噬體具有保護肝卵圓細胞的功能，促進細胞的生存，缺血缺氧誘導的自噬可能吞噬殘余的細胞器，釋放必需氨基酸，從而維持細胞的生存和功能。自噬體的產(chǎn)生在一定時間內(nèi)可以延緩或阻止細胞調(diào)亡，可能與HOC在缺血缺氧微環(huán)境中細胞的生存和功能的維持有關(guān)。

綜上所述，研究HOC自噬對于深入理解HOC參與肝再生、肝癌的發(fā)生以及HOC臨床運用等均具有重要意義。

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