張 珍，魏義花，杜鎮(zhèn)鎮(zhèn)，周秀芝(濱州醫(yī)學院：.病原生物學實驗室；.臨床學院，山東 濱州56603)

幽門螺桿菌是引起人類胃炎、消化道潰瘍及胃癌的重要病原體，是一種微需氧、彎曲狀的革蘭陰性桿菌[1]。幽門螺桿菌的致病能力與其菌體表面的熱休克蛋白60(hsp60)密切相關[2]，不同菌株的 hsp60氨基酸序列即GroEL蛋白相對保守、抗原性較強[3]，主要通過刺激單核-巨噬細胞或胃上皮細胞釋放 IL-1β、IL-8、TNF-α 等炎癥細胞因子加劇病情的發(fā)展[4]，但不同來源的幽門螺桿菌菌株及其hsp60對細胞因子分泌是否有差異鮮見報道。本實驗通過基因定點突變、蛋白表達等技術獲得了幽門螺桿菌標準株26695的hsp60(即非胃癌來源株)與胃癌來源株的重組熱休克蛋白(rhsp60)[5]，將不同濃度的2種蛋白與U937細胞共培養(yǎng)，在前期證實rhsp60可促進IL-6的分泌的基礎上[6]，觀察其對U937細胞分泌TNF-α、IL-17的影響，旨在研究不同來源菌株的菌體成分感染與細胞因子表達水平的關系，進一步明確幽門螺桿菌的致病機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與細胞株 大腸桿菌BL21、幽門螺桿菌標準菌株ATCC26695、人髓系白血病細胞系U937細胞為本實驗室保存。

1.1.2 試劑 rhsp60與hsp60蛋白(本實驗室自制保存)，RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone生物制品公司)，TNF-α、IL-17 試劑盒(美國 RD 公司)，佛波酯(PMA)(Sigma公司)。

1.1.3 儀器 生物安全柜(上海博迅實業(yè)公司)，全自動高壓滅菌器(日本三洋電器公司)，倒置熒光顯微鏡IX70-142(日本奧林巴斯)，全自動酶標儀、細胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 U937細胞的培養(yǎng)與PMA處理 將凍存的U937細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代，對數生長期時用預溫的RPMI-1640洗2次，懸于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調整細胞濃度達每毫升1×109個，取濃度為1 μg/mL的PMA加入培養(yǎng)瓶中，使其終濃度為10 ng/mL，培養(yǎng)14 h以上換液，倒置顯微鏡下細胞由獨立的、懸浮的小圓形變?yōu)槌蓤F的、貼壁的、形狀不規(guī)則的細胞[7]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h即可分化成巨噬細胞樣細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 ELISA檢測TNF-α和IL-17的分泌 取對數生長期已經分化的U937細胞用RPMI-1640培養(yǎng)12 h棄上清液，用RPMI-1640培養(yǎng)液重懸，調整細胞濃度為每毫升2×106個接種到24孔細胞培養(yǎng)板，分別加hsp60(hsp60 組)、rhsp60(rhsp60 組)，最終濃度調整為 50、100、200 μg/mL，12、18、24 h 分別收集上清液保存待測，以加等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)的細胞培養(yǎng)組作為對照組。TNF-α、IL-17的檢測嚴格按照說明書操作，酶標儀450 nm測定樣品光密度(OD)值，ELISA標準品質量濃度為20～320 pg/mL，由繪制的標準曲線計算出樣品中TNF-α、IL-17含量。以上實驗，不同濃度均采用3個復孔。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行數據處理，計量資料以±s表示，采用 t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 rhsp60與hsp60刺激U937細胞后TNF-α的分泌不同濃度的rhsp60、hsp60與U937細胞共培養(yǎng)，在12、18、24 h測得兩組TNF-α分泌量均明顯高于對照組，且同時間點、同濃度下rhsp60組明顯高于hsp60組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表 1。

表1 各組不同時間點細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α水平比較(±s，pg/mL)

表1 各組不同時間點細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α水平比較(±s，pg/mL)

注：與對照組同時間點比較，aP＜0.05；與同濃度、同時間點hsp60組比較，bP＜0.05。

組別hsp60組50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL rhsp60組50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL對照組培養(yǎng)時間(h)12 18 24 97.02±6.25a 145.23±9.71a 194.23±11.30a 131.39±8.04ab 181.49±9.01ab 241.32±11.31ab 56.25±3.87 127.34±8.24a 184.23±7.05a 219.27±10.11a 150.27±9.77ab 201.12±11.72ab 267.03±9.64ab 68.43±5.01 141.25±11.20a 197.64±9.64a 231.23±8.11a 161.55±9.82ab 217.08±12.35ab 275.17±11.05ab 81.32±5.46

2.2 rhsp60與hsp60刺激U937細胞后IL-17的分泌不同時間點兩組IL-17分泌量均明顯高于對照組，且同時間點、同濃度下rhsp60組高于hsp60組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表 2。

表2 各組不同時間點細胞培養(yǎng)上清液中IL-17水平比較(±s，pg/mL)

表2 各組不同時間點細胞培養(yǎng)上清液中IL-17水平比較(±s，pg/mL)

注：與對照組同時間點比較，aP＜0.05；與同濃度、同時間點hsp60組比較，bP＜0.05。

組別hsp60組50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL rhsp60組50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL對照組培養(yǎng)時間(h)12 18 24 45.12±3.41a 57.28±4.97a 68.51±6.38a 58.42±4.87a 69.51±7.02a 79.83±6.37a 64.41±8.21a 74.07±7.30a 84.85±6.94a 57.34±4.84ab 69.49±5.07ab 83.32±5.68ab 40.25±3.76 78.86±6.31ab 83.32±6.02ab 99.03±7.95ab 51.33±4.32 85.55±5.90ab 91.11±7.54ab 107.17±8.35ab 58.17±6.45

3 討 論

前期通過對幽門螺桿菌胃癌來源與非胃癌來源菌株的熱休克蛋白hsp60全基因序列比對，發(fā)現2類菌株的基因序列在1398、1399位點上存在差異[8]，胃癌來源菌株為GC；非胃癌來源菌株為AG，與幽門螺桿菌標準株ATCC26695相同[9]。本實驗通過定點突變、PCR等技術使基因序列的1398、1399位點由AG突變?yōu)镚C，成功獲得了胃癌來源突變株的重組rhsp60基因片段，其相應表達的編碼蛋白467位點也由非胃癌來源株的谷氨酸變?yōu)槲赴﹣碓粗甑墓劝滨０?，氨基酸的變化可能會引起空間結構改變進而影響到熱休克蛋白的功能。在前期證實rhsp60可刺激U937分泌IL-6增多的基礎上，本實驗顯示，rhsp60也可促進TNF-α、IL-17的分泌，與標準菌株的hsp60在同時間點、同濃度相比，存在顯著差異，提示幽門螺桿菌熱休克蛋白在促炎性細胞因子的分泌上可能存在菌株的差異，不同菌株具有不同的毒力及致病性。

病原菌感染機體后，一些炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β等作為細胞間的信使分子，受到病原菌刺激后往往分泌增加，以較高的親和力與相應的靶細胞表面受體結合，以增強抗感染效應促進炎癥發(fā)展[10]。其中TNF-α主要由活化的單核巨噬細胞產生，具有介導炎性反應、參與免疫及內分泌調節(jié)等廣泛的生物學作用；IL-17也是一種促進炎癥發(fā)生的較重要的可溶性因子，能促進機體產生趨化因子使中性粒細胞、單核細胞迅速增多并刺激機體產生IL-1和前列腺素E2等，進一步增強局部炎癥[11]。臨床資料也證實，幽門螺桿菌是大多數胃炎、胃與十二指腸潰瘍的病因，炎癥的增強有誘發(fā)癌變的可能，進而導致嚴重后果[12]。因此，研究幽門螺桿菌不同的菌株或菌體成分在炎癥發(fā)展中的作用，并明確炎癥因子分泌的信號通路機制，有助于探討新的治療方法阻止炎癥的發(fā)展與癌變以促進人類的健康。

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