李江姣 杜慧竟 石繼春 陳翠萍 徐 苗 葉 強(qiáng)

中國食品藥品檢定研究院 衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室，北京 100050

肺炎球菌疫苗的保護(hù)力可以通過臨床效力試驗來確定[1]，但由于需要的樣本量大、費用高、周期長等原因臨床效力試驗往往不易實施。建立與肺炎球菌疫苗保護(hù)力相關(guān)聯(lián)的實驗室檢測手段，使用血清學(xué)檢測結(jié)果作為觀察終點，能夠協(xié)助疫苗效力試驗評估肺炎球菌疫苗的保護(hù)力，大大縮短周期。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）進(jìn)行的莢膜多糖特異性IgG抗體的定量測定，是目前比較成熟的在嬰幼兒新型肺炎球菌疫苗審批中使用的臨床效力評價方法[2]。而由于成人存在交叉反應(yīng)抗體，用ELISA法檢測的IgG抗體特異性較低[3]，因此人們試圖尋找特異性高并與疫苗保護(hù)力相關(guān)性更高的替代試驗。

相比ELISA方法，體外調(diào)理吞噬試驗（Opsonop-hagocytic assay，OPA）可以反映機(jī)體抵御肺炎球菌感染的體內(nèi)機(jī)制[4-5]，其結(jié)果能更加真實地反映肺炎球菌疫苗的保護(hù)效力[6-7]，因此OPA技術(shù)在國際疫苗監(jiān)管體系中受到越來越多的重視，并得到了不斷的發(fā)展和優(yōu)化。隨著OPA技術(shù)的發(fā)展，一些實驗室改用HL-60細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，代替外周血淋巴細(xì)胞，并對試劑和試驗步驟進(jìn)行優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，美國阿拉巴馬大學(xué)肺炎鏈球菌血清學(xué)參比實驗室研發(fā)的多重調(diào)理吞噬實驗技術(shù)（multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA）能夠同時進(jìn)行4個血清型的功能抗體檢測，極大提高了多價疫苗的檢測效率，促進(jìn)了該項技術(shù)的推廣應(yīng)用[8]。然而由于操作相對復(fù)雜，技術(shù)要求高，我國長期以來對該方法的研究和應(yīng)用均較缺乏。為了提升我國藥檢機(jī)構(gòu)對肺炎球菌疫苗的免疫效果評價水平，本研究組前期已經(jīng)成功建立起MOPA技術(shù)[9]，利用該技術(shù)對13價肺炎球菌結(jié)合疫苗免疫后的12份嬰兒血清樣本進(jìn)行了OPA滴度檢測，并與相應(yīng)的ELISA結(jié)果進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示，OPA法與ELISA法測定的血清抗體效價的相關(guān)性較高，二者結(jié)果具有良好的一致性[10]。

為了進(jìn)一步對所建立的MOPA技術(shù)進(jìn)行驗證，本研究在兩個不同實驗室[中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱“我院”）及該技術(shù)的發(fā)明單位美國阿拉巴馬大學(xué)肺炎球菌血清學(xué)參比實驗室]利用MOPA技術(shù)對同一組血清樣本（19份血清）針對13個血清型肺炎球菌的OPA滴度分別進(jìn)行了兩輪MOPA檢測，并對兩實驗室間結(jié)果及我院內(nèi)的兩輪結(jié)果進(jìn)行了比較分析，旨在通過與國際參比實驗室的比較來檢驗我們建立的MOPA方法的重復(fù)性（我院內(nèi)比較）和再現(xiàn)性（兩個實驗室間比較），進(jìn)而為我國藥檢機(jī)構(gòu)應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行肺炎球菌疫苗免疫效力評價的可靠性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HL-60 細(xì)胞系購自美國 ATCC（CCL-240）；13 種血清型的肺炎鏈球菌靶菌、19份血清樣本、以及乳兔補(bǔ)體來源于美國阿拉巴馬大學(xué)肺炎鏈球菌血清學(xué)參比實驗室。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 我院使用的試劑及儀器 二甲基甲酰胺（DMF）（批號：3345C432）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（批號：2532B313）、鏈霉素（Streptomycin，批號：2036B318）購自美國梭倫Amresco公司；奧普脫欣（Optochin，批號：051M1257V）、奇 霉 素 （Spectinomycin， 批 號 ：102K05 447V）、甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim，批號：BCBC9232V）購于美國圣路易斯Sigma公司；菌落計數(shù)器 （型號：ProtoCOL 3）購自英國劍橋Synbiosis公司。

1.2.2 美國阿拉巴馬大學(xué)肺炎鏈球菌血清學(xué)參比實驗室使用的試劑及儀器 DMF（批號：107575）購自美國匹茲堡 Fisher Scientific公司；TTC（批號：BCBP3272V）、鏈霉素（Streptomycin，批號：SLBH9702V）、奧普脫欣（Optochin，批號：051M1269V）、奇霉素（Spectinomycin，批號：102K05782V）、甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim，批號：BCBN2518V）購于美國圣路易斯Sigma公司；菌落計數(shù)器（型號：ProtoCOL 3）購自英國劍橋Synbiosis公司。

1.3 OPA滴度檢測

OPA滴度檢測采用可同時檢測4種血清型的多重調(diào)理吞噬實驗方法（MOPA法）。具體操作步驟見參考文獻(xiàn)[9-10]。我院及美國阿拉巴馬大學(xué)肺炎鏈球菌血清學(xué)參比實驗室對19份血清樣本的13個血清型分別進(jìn)行兩輪MOPA檢測，每輪MOPA試驗中的每個血清樣本均平行測定2次，取平均值作為每輪試驗的結(jié)果值。

1.4 結(jié)果分析

進(jìn)行兩實驗室間的結(jié)果比較時，取各自實驗室兩輪MOPA試驗結(jié)果的平均值作為各自實驗室的最終結(jié)果值。將OPA滴度值轉(zhuǎn)換為以10為底的對數(shù)，進(jìn)行線性回歸分析，計算相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果

19份血清樣本針對13個血清型肺炎球菌的OPA滴度在兩實驗室間及我院內(nèi)的比較結(jié)果見圖1（封三）。圖1可以看出，兩實驗室間比較及我院內(nèi)比較產(chǎn)生的點均大部分集中聚集在一致線上及其附近，提示結(jié)果有著良好一致性。實驗室間比較的點相較與實驗室內(nèi)比較的點分布稍微分散。19份血清樣本針對13個血清型肺炎球菌的OPA滴度在兩實驗室間及本室兩輪試驗的相關(guān)系數(shù)統(tǒng)計結(jié)果具體見表1。

3 討論

特異性抗體、補(bǔ)體與吞噬細(xì)胞表面結(jié)合，促進(jìn)吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌等顆粒性抗原的過程稱為調(diào)理吞噬作用，是人類宿主抵抗肺炎球菌感染的主要機(jī)制[4]。由于OPA技術(shù)可以直接測定具有調(diào)理吞噬功能的功能性抗體水平[5]，并且與肺炎球菌疫苗免疫保護(hù)效力的相關(guān)性比ELISA法更高[6-7]，因而OPA技術(shù)在國際上受到越來越多的關(guān)注和應(yīng)用[11-15]。2013年美國惠氏公司的13價肺炎球菌結(jié)合疫苗在歐洲被批準(zhǔn)用于50歲以上成人使用時，采用OPA技術(shù)進(jìn)行臨床效果評價[16-17]。2015年美國默沙東公司新注冊的的15價肺炎球菌結(jié)合疫苗使用OPA法進(jìn)行臨床評價[18]。

表1 MOPA實驗比較結(jié)果的相關(guān)系數(shù)

然而，由于OPA試驗操作相對復(fù)雜，對實驗室條件及操作人員專業(yè)技術(shù)要求高，因而其大范圍的推廣應(yīng)用受到了一定程度限制。OPA試驗中涉及的活性物質(zhì)較多，需要經(jīng)過反復(fù)摸索逐漸掌握。首先，效應(yīng)細(xì)胞是OPA實驗中一個重要部分，也是比較難于掌控的一個環(huán)節(jié)。許多實驗室在建立OPA技術(shù)時遇到的主要障礙來自HL-60細(xì)胞的操作。因為該方法不僅要求實驗室具備細(xì)胞培養(yǎng)能力，還得確保HL-60細(xì)胞能夠有效分化為中性粒細(xì)胞樣吞噬細(xì)胞。誘導(dǎo)劑DMF的濃度、細(xì)胞分化時間以及用于分化的細(xì)胞數(shù)量都需嚴(yán)格控制。其次，該方法中各血清型的活性靶菌數(shù)均需控制在70～180 cfu范圍內(nèi)以保證計數(shù)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，而實驗中各種原因常常導(dǎo)致靶菌數(shù)量波動和超出范圍，容易導(dǎo)致試驗失敗。再次，本方法對補(bǔ)體的要求也比較高，要求補(bǔ)體自身的非特異性殺菌力不能太強(qiáng)，需經(jīng)過篩選。正由于該方法試驗操作復(fù)雜，技術(shù)性要求高，目前在國內(nèi)的發(fā)展和應(yīng)用仍比較缺乏。為了促進(jìn)該技術(shù)在國內(nèi)的應(yīng)用，我院前期構(gòu)建了該技術(shù)所需的HL-60主代細(xì)胞庫、13種血清型的工作菌種批，完成了相應(yīng)的有效性檢測，最終成功建立起MOPA技術(shù)[9]。隨后利用建立的MOPA技術(shù)完成了12份血清樣本的13種血清型的OPA滴度檢測，并與相應(yīng)的ELISA結(jié)果進(jìn)行了比較分析，得到較高的一致性結(jié)果[10]。

為了進(jìn)一步對所建立的MOPA技術(shù)進(jìn)行驗證，本研究組利用MOPA技術(shù)對19份血清樣本針對13個血清型肺炎球菌的OPA滴度在兩個實驗室（我院和美國阿拉巴馬大學(xué)MOPA技術(shù)發(fā)明實驗室）分別進(jìn)行了兩輪檢測，并對兩實驗室間結(jié)果及我院內(nèi)兩輪結(jié)果進(jìn)行比較分析，通過與國際權(quán)威參比實驗室的結(jié)果比較來檢驗建立的MOPA技術(shù)的再現(xiàn)性和重復(fù)性。本研究結(jié)果顯示：全部13個血清型的總的實驗室間和總的實驗室內(nèi)相關(guān)系數(shù)均較高，分別為0.94和0.96。各血清型的實驗室間和實驗室內(nèi)相關(guān)系數(shù)范圍分別為0.87～0.99 和 0.68～0.99。 1、3、5、6A、6B 型在兩實驗室間測定的OPA滴度相關(guān)性很高，其中1、5型的兩實驗室間相關(guān)性最高，均為0.99。4型和9V型在兩實驗室間相關(guān)性相對略低，分別為0.87和0.88。9V型在我院內(nèi)兩次OPA結(jié)果相關(guān)系數(shù)偏低，可能是由于兩次實驗中所用效應(yīng)細(xì)胞的分化狀態(tài)不同導(dǎo)致?？傮w上看，13個血清型的總實驗室內(nèi)相關(guān)系數(shù)高于總實驗室間相關(guān)系數(shù)；各血清型分開來看，多個型別的實驗室內(nèi)相關(guān)系數(shù)小于實驗室間相關(guān)系數(shù)，可能由于兩實驗室間進(jìn)行比較的數(shù)值是各自實驗室兩輪OPA試驗的平均值，結(jié)果值更為準(zhǔn)確一些。國際上有過6個實驗室同時用OPA法檢測16份血清樣本的研究，得出實驗室間相關(guān)系數(shù)范圍為0.71～0.91[19]。本研究證實我院建立的MOPA方法具有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性，不低于國際同等水平。

綜上所述，本研究證明所建立的MOPA方法具有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性。未來還將對建立的MOPA方法做更多的驗證，如特異性、精密性等，以逐步完善該方法的整體驗證，最終為該技術(shù)成功應(yīng)用于肺炎球菌疫苗的臨床免疫效果評價，并為實現(xiàn)在我國藥檢機(jī)構(gòu)的推廣提供基礎(chǔ)。

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