郭文麗，汪曉冬，廖振宇，艾玉，曹東麗

（天津市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)技術(shù)研究院，天津300384）

GB2760-2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，乳制品中不得使用苯甲酸等防腐劑用于生鮮乳保鮮[1]。在實(shí)際檢測(cè)中，部分乳制品中能檢出苯甲酸。研究表明乳制品中的苯甲酸會(huì)天然存在，其絕大部分是生產(chǎn)過(guò)程中原料乳中馬尿酸脫去甘氨酸生成，并且這個(gè)反應(yīng)是不可逆的[2]。馬尿酸（Hippuric Acid，HA）又名苯甲酰氨基乙酸，是食植動(dòng)物代謝的副產(chǎn)物，多存在于馬和草食性動(dòng)物的尿液中，也可通過(guò)乳汁排出，同時(shí)會(huì)存在于原料奶中[3]。因此，為了更好地研究乳制品中苯甲酸的來(lái)源，建立了能夠同時(shí)測(cè)定乳制品中馬尿酸和苯甲酸含量的HPLC 方法，該方法對(duì)控制、解決乳制品的安全衛(wèi)生問(wèn)題具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Agilent1260 series；美國(guó)Agilent公司）；色譜柱（Waters 柱，150 mm×4.6 mm，粒度2.7 μm）；離心機(jī)（H2050R；長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；恒溫振蕩器（HNY-100B；天津市歐諾儀器儀表有限公司）。

1.2 主要試劑

乙腈（HPLC 級(jí)，DikmaPure 公司）；甲醇（HPLC 級(jí)，DikmaPure 公司）；苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.EhrenstorferGmbH）、馬尿酸對(duì)照品；醋酸；磷酸二氫鉀；KH2PO4；氫氧化鈉；去離子水。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱(chēng)取馬尿酸和苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg，于50 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配置成濃度各為100 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密量取濃度為100 μg/mL 的馬尿酸和苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用50%甲醇溶液定容，配置成濃度為0、0.1、0.2、0.5、1、5 μg/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 高效液相色譜參數(shù)的優(yōu)選[2，4-5]

本實(shí)驗(yàn)采用單因素法，對(duì)HPLC 同時(shí)測(cè)定馬尿酸、苯甲酸的主要參數(shù)——流動(dòng)相、柱溫、流速、進(jìn)樣量等進(jìn)行優(yōu)選。選用1 μg/mL 的馬尿酸、苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行優(yōu)選實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 流動(dòng)相種類(lèi)的優(yōu)選

分別用下列不同的流動(dòng)相對(duì)1 μg/mL 的馬尿酸、苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。

（1）甲醇+0.4%醋酸溶液=35+65

（2）乙腈+0.4%醋酸溶液=35+65

（3）甲醇+0.05 mol/L 磷酸溶液=35+65

（4）乙腈+0.05 mol/L 磷酸溶液=35+65

（5）甲醇+0.02 mol/L KH2PO4溶液=35+65

（6）乙腈+0.02 mol/L KH2PO4溶液=35+65

1.3.2 流動(dòng)相溶劑配比的優(yōu)化

在確定流動(dòng)相后，進(jìn)一步優(yōu)選流動(dòng)相溶劑配比。分別以乙腈+0.4%醋酸溶液=15+85、25+75、35+65、45+55、55+45 為流動(dòng)相，對(duì)1 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 柱溫的優(yōu)選

在確定流動(dòng)相配比后，分別設(shè)定柱溫為25、30、35、40、45 ℃，以確定最適溫度。

1.3.4 流速的優(yōu)選

設(shè)定儀器流速0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL/min，檢測(cè)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)的分離度、峰型等選擇合適的流速。

1.3.5 進(jìn)樣量的優(yōu)選

分別設(shè)定進(jìn)樣量為5、10、15、25、50μL，測(cè)定1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 預(yù)處理?xiàng)l件

樣品提取[6]。

在提取馬尿酸和苯甲酸時(shí)，要去除牛奶中的大分子干擾物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂肪等。稱(chēng)取20 g 樣品（精確至0.01 g）于100 mL 容量瓶中，加入25 mL0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，混合后置于超聲波水浴或70 ℃水浴中處理15 min。冷卻后，用0.5 mol/L 硫酸溶液將pH 調(diào)節(jié)到8（用pH 計(jì)或pH 試紙均可），分別加入2 mL 92 g/L亞鐵氰化鉀溶液和183 g/L 乙酸鋅溶液。劇烈振搖，靜置15 min，混合后冷卻到室溫，再用甲醇定容，靜置15 min，4 000 r/min 離心，上清液經(jīng)過(guò)0.22 μm 濾膜過(guò)濾。收集濾液作為試樣溶液，用于高效液相色譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，（2）流動(dòng)相峰高較高、峰型相對(duì)較好、靈敏度較大；基于與雜質(zhì)色譜峰的分離度、峰高、峰寬以及對(duì)稱(chēng)性等因素，其35+65 的相配是最優(yōu)選擇；35 ℃時(shí)，2種物質(zhì)的色譜峰高而窄，對(duì)稱(chēng)性好；0.6 mL/min 時(shí)，2種目標(biāo)物得到了很好的分離，且分析時(shí)間短；進(jìn)樣量為10 μL 時(shí)色譜峰對(duì)稱(chēng)性好，峰高高。

綜上所述，本文選擇的色譜條件為：流動(dòng)相組成：A 通道為去離子水，B 通道為甲醇（色譜純），C 通道為乙腈（色譜純），D 通道為0.4%醋酸溶液（已抽濾）；柱溫35 ℃；流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)235 nm。

2.2 線性方程

對(duì)濃度為0、0.1、0.2、0.5、1、5 μg/mL 的馬尿酸、苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定其相應(yīng)的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程、相關(guān)系數(shù)：

Y=10.250 622 5×X-0.417 895 6 R=0.999 0（馬）

Y=10.556 950 4×X+0.378 122 6 R=0.999 8（苯）

式中：Y 為面積；X 為含量。

圖1 馬尿酸、苯甲酸混合標(biāo)準(zhǔn)品譜圖（1.0 μg/mL）Fig.1 Chromatogram of mixture HA and Benzoic Acid sample（1.0 μg/mL）

在圖1中馬尿酸（HA）的出峰時(shí)間為2.841，苯甲酸（BJS）的出峰時(shí)間為4.594。

2.3 檢測(cè)靈敏度（方法測(cè)定低限）

根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T27404-2008，方法的測(cè)定低限按下式計(jì)算：

式中：CL 為方法的測(cè)定低限；Sb 為空白值標(biāo)準(zhǔn)偏差（一般平行測(cè)定20 次得到）；b 為方法校準(zhǔn)曲線的斜率。

在本實(shí)驗(yàn)中Sb=1.113 767，b=10.250 622 5，根據(jù)上式計(jì)算方法測(cè)定低限為0.326 mg/kg（馬）；Sb=1.235 521，b=10.556 950 4，根據(jù)上式計(jì)算方法測(cè)定低限為0.351 mg/kg（苯）。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

取牛奶樣品，做空白對(duì)照。分別作0.5、5、10 mg/kg 3個(gè)水平、6 個(gè)平行添加回收率實(shí)驗(yàn)。樣品按照前述實(shí)驗(yàn)步驟操作測(cè)定。結(jié)果如下表。

表1 牛奶苯甲酸、馬尿酸的回收率Table1 Recoveries of Benzoic acid，HA in milk

2.5 精密度

分別取2 個(gè)水平，濃度為0.2、1 μg/mL 的馬尿酸、苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在本文選取的最佳參數(shù)下做平行，進(jìn)樣7 次，測(cè)定相應(yīng)的峰面積。結(jié)果表明，本法的RSD（%）＜2%，具有良好的精密度，較高的重現(xiàn)性。且濃度較低時(shí)，相對(duì)偏差較大；濃度較大時(shí)，相對(duì)偏差較小。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table2 The result of the precision experiment

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

在HPLC 分析中，通過(guò)峰的保留時(shí)間將標(biāo)準(zhǔn)色譜峰與樣品色譜峰對(duì)照、定性，同時(shí)可查看相應(yīng)峰的吸收波長(zhǎng)進(jìn)行精確判斷。然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品中2種目標(biāo)物質(zhì)的含量。在市場(chǎng)流通領(lǐng)域選取多家品牌不同規(guī)格的產(chǎn)品，樣品經(jīng)前處理后進(jìn)行檢測(cè)。在對(duì)13種純牛奶檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)1種樣品含有馬尿酸及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物苯甲酸（見(jiàn)圖2）。

圖2 某純牛奶樣品檢測(cè)譜圖Fig.2 Chromatogram of milk sample

圖2為該純牛奶樣品的檢測(cè)譜圖。根據(jù)公式計(jì)算得出該樣品中馬尿酸的含量為4.6 mg/kg，苯甲酸的含量為3.4 mg/kg。

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)測(cè)定乳制品中馬尿酸、苯甲酸的HPLC 方法，本方法的相關(guān)系數(shù)分別為0.999 0 和0.999 8；檢出限分別為0.326 mg/kg 和0.351 mg/kg；方法的RSD（%）（n=7）＜2%，說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確度、精密度和較高的重現(xiàn)性，適用于乳與乳制品中馬尿酸和苯甲酸的殘留分析。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)提供的方法可以方便、可靠地分析乳制品中苯甲酸的本底水平，有助于科學(xué)、準(zhǔn)確的綜合判定。

[1] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 2760-2011 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011:352

[2] 謝國(guó)祥,吳麗莉,宋如森,等.乳制品中馬尿酸的檢測(cè)及其在發(fā)酵過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化研究[J].分析檢驗(yàn),2005(9):426-429

[3] 顧瑞霞.乳與乳制品的生理功能特性[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2000:213

[4] The International Dairy Federation.IDF 139 Milk,Dried Milk, Yogurt and Other Fermented Milks Determination of Benzoic and Sorbic Acid content[S].Belgium:IDF,1987

[5] 陳亞成,賈彩鳳,王疆元,等.牛乳中苯甲酸的HPLC 測(cè)定及來(lái)源分析[J].食品工業(yè)科技,2010(6):94-95,99

[6] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB 21703—2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)乳和乳制品中苯甲酸和山梨酸的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010:6