王婧，周有祥，嚴(yán)偉，丁華，趙明明，劉浩，楊潔

摘要：以黑米為材料，采用HPLC-DAD法和UPLC-MS/MS法，鑒定其中的花青素主要為矢車菊素-3-葡萄糖苷，并采用HPLC-DAD法對(duì)其進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，黑米中的矢車菊素-3-葡萄糖苷含量達(dá)（1.017±0.028） mg/g，遠(yuǎn)高于另外5種有色稻米中的矢車菊素-3-葡萄糖苷含量。該方法準(zhǔn)確、靈敏、高效、穩(wěn)定，可用于高花青素含量的黑米品種篩選。

關(guān)鍵詞：黑米;花青素;矢車菊素-3-葡萄糖苷;超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）;高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（HPLC-DAD）

中圖分類號(hào)：O657.7+2 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）23-5836-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.054

有色稻米是中國(guó)極其珍貴的特異水稻種質(zhì)資源，其糙米（穎果）帶有異于普通稻米的色澤，成色原因正是由于稻米種子發(fā)育過程中種皮沉積了大量花青素[1，2]。就種皮顏色而言，可分為紫（黑）米、紅米、黃米和綠米，其中以紫（黑）米和紅米最常見[3]?；ㄇ嗨兀ˋnthocyanins）是廣泛存在于自然界植物中的水溶性天然色素，屬于黃酮類物質(zhì)，在自然狀態(tài)下多以糖苷化和?；男问酱嬖?，稱為花色苷[4]。Abdel-all等[5]研究結(jié)果認(rèn)為，組成黑米與紅米的主要花青素苷為矢車菊素-3-葡萄糖苷（Cyanidin-3-glucoside， C-3-G）。施怡如等[6]對(duì)具紫色植株的水稻品種Purpleputtu的研究表明，該植株紫色或紅色的組織中均含有花青素，其中主要成分為矢車菊素（Cyanidin），而花青素含量最多的部位就是穎果皮。Reddy等萃取紫黑色、白色、褐色穎果皮的試驗(yàn)表明，白色及褐色穎果皮的水稻品種并未檢測(cè)到花青素，但大部分紫黑色穎果皮的品種含有Cyanidin-3-glucoside和Peonidin-3-glucoside兩種花青素，且以Cyanidin-3-glucoside為主要成分，顏色愈深的穎果皮含有較多的花青素。

長(zhǎng)期以來，對(duì)黑米評(píng)價(jià)研究主要集中在農(nóng)藝性狀和主要營(yíng)養(yǎng)成分的分析，而對(duì)其生理活性物質(zhì)方面的研究較少[7]。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，目前花青素常用的檢測(cè)方法有可見分光光度法、紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法等[8-10]。但單純使用UV或HPLC均存在檢測(cè)靈敏度低、檢測(cè)用時(shí)長(zhǎng)等不足[11]。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）具有選擇性好、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)以黑米為試驗(yàn)材料，建立UPLC-MS/MS測(cè)定方法，分析黑米中矢車菊素的含量，旨在為有色稻米花青素的組分分析提供新的方法，可用于從有色稻米種質(zhì)資源中篩選高花青素含量的品種。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料與試劑

黑米樣品：黑津原1號(hào)，由天津市原種場(chǎng)提供，其他樣品由本實(shí)驗(yàn)室提供;矢車菊素-3-葡萄糖苷（Cy-3-g1u）標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）購(gòu)自百靈威科技有限公司;常規(guī)試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 ?儀器

Waters 2695-2998型高效液相色譜儀-二極管陣列檢測(cè)器（Waters，美國(guó)）;KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;Laborota-4010型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph，德國(guó)），MS1振蕩器（IKA，德國(guó)）;ACQUITY UPLC-Xevo TQ型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（Waters，美國(guó)），配有電噴霧離子源（ESI）及MassLynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

1.3 ?方法

1.3.1 ?前處理 ?將適量黑米樣品用旋風(fēng)磨粉碎，過80目篩，獲得試驗(yàn)用黑米粉。準(zhǔn)確稱取5 g樣品于250 mL三角瓶?jī)?nèi)，加入50 mL 90%甲醇溶液（含0.1%鹽酸，V/V），超聲提取30 min，將樣品提取液通過濾紙，過濾至100 mL棕色容量瓶中，重復(fù)提取兩次，合并兩次提取液，搖勻，甲醇定容，過0.22 μm濾膜后，待測(cè)。

1.3.2 ?標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 ?精確稱量Cy-3-g1u標(biāo)準(zhǔn)品1.08 mg，用甲醇溶解定容至10 mL，得到108 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用前配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 ?液相色譜條件 ?Inertsil ODS-3 色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm） ，流動(dòng)相A（0.1%甲酸溶液）-B（含0.1%甲酸的甲醇溶液），流速為0.8 mL/min;梯度洗脫：0～5 min，A∶B（10∶90～30∶70）;5～12 min，A∶B（30∶70～50∶50）;12～15 min，A∶B（10∶90）;檢測(cè)波長(zhǎng)為519 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.4 ?超高效液相色譜-質(zhì)譜條件 ?UPLC條件：色譜柱Acquitytm UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相A（0.1%甲酸溶液）-B（含0.1%甲酸的甲醇溶液），等度洗脫（20%B），流速為0.2 mL/min，柱溫為30 ℃。

質(zhì)譜條件：MS條件自動(dòng)優(yōu)化，ESI+全掃描模式;毛細(xì)管電壓3.0 kV;錐孔電壓30 V;二級(jí)錐孔電壓3 V;離子源溫度：150 ℃;脫溶劑氣溫度350 ℃;脫溶劑氣流量300 L/H;錐孔氣流量40 L/H。

1.3.5 ?回收率試驗(yàn) ?稱取0.9 g精白米粉（預(yù)實(shí)驗(yàn)表明不含Cy-3-g1u）3份，分別加入0.1 g黑米粉樣品，按照供試品溶液制備，采用HPLC方法分析樣品中的Cy-3-g1u含量。

回收率=m1/m2×10×100%，其中：m1為混入黑米以后精白米樣品中的Cy-3-g1u含量，mg/g;m2為黑米樣品中的Cy-3-g1u含量，mg/g;10為精白米-黑米混合物和混入的黑米的質(zhì)量比。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?矢車菊素的定性分析

文獻(xiàn)報(bào)道，花青苷類化合物分別在265～275 nm和 465～560 nm處有 2個(gè)特征吸收峰[4，12]。本黑米樣品中存在11.6 min處色譜峰的光譜圖（λmax=280， 519 nm）與報(bào)道一致（圖1），初步確定樣品中含有花色苷。隨后收集HPLC色譜的流出組分，并采用UPLC-MS/MS法對(duì)該峰進(jìn)行分子量的分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在正離子模式下，11.6 min的色譜峰出現(xiàn)兩個(gè)離子峰，分別為m/z=449和287，參考文獻(xiàn)[11]，確定11.6 min的色譜峰為Cy-3-g1u，其中m/z=449為Cy-3-g1u的母離子[M+H]+;m/z=287為Cy-3-g1u在質(zhì)譜條件下，糖苷鍵斷裂，僅有矢車菊素的碎片峰[M-Glucose+H]+。

為進(jìn)一步確證該化合物為Cy-3-g1u。本試驗(yàn)以Cy-3-g1u標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)照，標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜見圖3。由圖3可知，樣品和Cy-3-g1u標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和光譜圖一致，故可判斷黑米樣品中11.6 min處的色譜峰為Cy-3-g1u。

2.2 ?矢車菊素的定量分析

2.2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 ?將不同質(zhì)量濃度的矢車菊素-3-葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行HPLC分析，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）。由圖4可知，當(dāng)矢車菊素-3-葡萄糖苷質(zhì)量濃度在20～150 μg/mL時(shí)，Cy-3-g1u與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程y=32 765x-19 988，R2= 0.998 3。

2.2.2 ?回收率試驗(yàn) ?為驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，采用樣品加標(biāo)方法進(jìn)行回收率試驗(yàn)。由于Cy-3-g1u標(biāo)準(zhǔn)品含量過低，因此，本試驗(yàn)將高含量的樣品黑津原1號(hào)加入到精白米樣品混勻后，進(jìn)行含量分析，以測(cè)定結(jié)果與混入樣品質(zhì)量的百分比為回收率。結(jié)果表明，3個(gè)平行樣品的Cy-3-g1u回收率分別為93.4%、90.4%、101.9%，平均值為95.2%，RSD為6.27%。該方法雖然不及直接使用標(biāo)準(zhǔn)品的精密度高[12，13]，但測(cè)得的回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8%，也在可接受范圍內(nèi)，并且節(jié)約了成本高昂的Cy-3-g1u標(biāo)準(zhǔn)品用量。

2.2.3 ?樣品分析 ?采用HPLC法分析黑津原1號(hào)和本實(shí)驗(yàn)室的5份有色稻米中的Cy-3-g1u含量，結(jié)果見表1。由表1可知，黑津原1號(hào)的Cy-3-g1u含量遠(yuǎn)高于其他5份樣品（達(dá)到中科黑糯1號(hào)的46倍），也遠(yuǎn)高于應(yīng)龍彬等[12]的報(bào)道，可推斷為矢車菊素-3-葡萄糖苷含量較高的一個(gè)品種。

3 ?小結(jié)與討論

HPLC法是依據(jù)樣品保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致作為鑒別標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，而UPLC-MS/MS法是通過對(duì)母離子、子離子和保留時(shí)間等多重標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定性、定量分析，結(jié)合了色譜法的高分離能力和質(zhì)譜法的高鑒定能力，最適合分析多組分混合物中未知組分。結(jié)果也顯示出不同樣品的矢車菊素-3-葡萄糖苷含量差異巨大，表明本研究建立的UPLC-MS/MS分析黑米中花青素的方法具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、高效可靠等特點(diǎn)，可用于從有色稻米種質(zhì)資源中選育高花青素含量的品種。花青素作為一種天然食用色素，安全、無(wú)毒、資源豐富，而且具有一定的營(yíng)養(yǎng)保健功能，花青苷類色素具有降低冠心病發(fā)病率、改善視敏度、抗氧化和抗癌活性[14]，在食品、化妝品、醫(yī)藥等方面有著巨大的應(yīng)用潛力[15]，因此研究和開發(fā)高花青素含量的有色稻米品種擁有良好的發(fā)展前景。

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