馬婷，李存治，毛靈琪，單風(fēng)娟，閆達(dá)中

摘要：以氯氰菊酯為惟一碳源與氮源，從生產(chǎn)氯氰菊酯的農(nóng)藥廠污水曝氣處理池的活性污泥樣品中，通過(guò)富集馴化和劃線分離，篩選出一株氯氰菊酯的高效降解菌DZS-3。經(jīng)氣相色譜檢測(cè)，3d內(nèi)其對(duì)氯氰菊酯的降解率為65.7%。形態(tài)學(xué)觀察，該菌圓形，周邊光滑，革蘭氏染色鑒定為革蘭氏陰性菌。通過(guò)16S rDNA序列分析及生理生化特性鑒定，將其初步鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬的一種（Stenotrophomonas sp.）。

關(guān)鍵詞：氯氰菊酯降解菌;篩選;鑒定;寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.）

中圖分類(lèi)號(hào)：X172;Q93-331 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）23-5708-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.022

擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)（Synthetic Pyrethroids）殺蟲(chóng)劑是一類(lèi)具有優(yōu)異生物活性、環(huán)境相容性較好的農(nóng)藥，它是繼有機(jī)磷、有機(jī)氯和氨基甲酸酯之后發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)殺蟲(chóng)劑[1]。該類(lèi)殺蟲(chóng)劑是模擬植物源農(nóng)藥——天然除蟲(chóng)菊酯合成的一類(lèi)含有多個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化學(xué)農(nóng)藥[2，3]。

氯氰菊酯是擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑中的一種，具有高效、廣譜、低毒等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于果樹(shù)、蔬菜的病蟲(chóng)防治，但其在環(huán)境中有一定的蓄積性，很難在自然條件下快速降解。氯氰菊酯的廣泛使用，造成了其在農(nóng)產(chǎn)品上的大量殘留和土壤、河流的污染，給生態(tài)環(huán)境和人類(lèi)自身的健康安全帶來(lái)了極大的威脅。農(nóng)藥殘留是影響我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品出口的重要屏障，農(nóng)藥殘留超標(biāo)勢(shì)必給我國(guó)的經(jīng)濟(jì)造成極大的損失。雖然國(guó)內(nèi)外關(guān)于處理擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的方法有很多的報(bào)道，但都不能從根本上消除農(nóng)藥殘留的問(wèn)題。如何有效地解決菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留的問(wèn)題，成為當(dāng)前人們面臨的一大難題。殘留在環(huán)境中的氯氰菊酯可以通過(guò)光降解、化學(xué)降解以及微生物的作用被降解。而與化學(xué)降解和光降解等方式相比較而言，農(nóng)藥的微生物降解具有安全、高效、費(fèi)用低、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，所以，以微生物降解為基礎(chǔ)的生物修復(fù)是一種環(huán)境友好型污染物消除技術(shù)，也是去除氯氰菊酯殘留的一種有效的手段。本研究旨在于分離篩選出新的高效降解氯氰菊酯的菌株，檢測(cè)其對(duì)氯氰菊酯的降解能力，探討直接用于氯氰菊酯引起的環(huán)境污染的微生物修復(fù)的可能性。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?主要儀器設(shè)備 ?自動(dòng)凝膠成像分析儀，PCR 擴(kuò)增儀，電泳儀，全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，顯微鏡，生化培養(yǎng)箱，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（PE Lambda 25），氣相色譜儀（Agilent）。

1.1.2 ?采集樣品 ?從江蘇某農(nóng)藥廠曝氣池排污口附近土壤采集樣品。

1.1.3 ?試劑 ?K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、NaCl、氯仿、環(huán)己烷均為分析純，瓊脂，牛肉浸取物，胰蛋白胨（Tryptone），酵母提取物（Yeast extract），氯氰菊酯原藥（純度94%）（氯氰菊酯原藥使用前先用乙醇或正己烷配成高濃度母液，并過(guò)濾除菌）。

1.1.4 ?擴(kuò)增16S rDNA 引物 ?primer 27F： 5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; primer 1492R： 5′GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.1.5 ?培養(yǎng)基

1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4·3H2O 1.5 g，KH2PO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.0 g，去離子水1 L。

2）增菌富集培養(yǎng)基：蛋白胨 2.0 g，NaC1 1.0 g，牛肉膏 1.0 g，去離子水 l L，pH 7.0～7.2。

3）LB培養(yǎng)基：NaCl 10 g，Yeast extract 5 g，Tryptone 10 g，去離子水 l L，pH 7.0。

往上述培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉即為固體培養(yǎng)基。

1.2 ?方法

1.2.1 ?氯氰菊酯降解菌的分離純化 ?稱(chēng)取污泥5 g，加入滅菌的裝有100 mL去離子水的三角燒瓶中，170 r/min、30 ℃，在搖床上振蕩1周，充分釋放污泥中的微生物[4]，然后將上清液5 mL和曝氣池液體5 mL加入到含氯氰菊酯濃度為50 mg/L的100 mL液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在搖床上30 ℃、170 r/min培養(yǎng)。按3%的接種量，每7 d轉(zhuǎn)接1次，每轉(zhuǎn)接1次氯氰菊酯濃度提高50 mg/L，直到氯氰菊酯濃度為250 mg/L。交替使用乙醇和正己烷溶解氯氰菊酯以消除溶劑對(duì)試驗(yàn)的干擾，確保篩選出的菌株能夠利用氯氰菊酯農(nóng)藥作為惟一碳源、氮源生長(zhǎng)。取菌液按100，10-2 ，10-4，10-6 進(jìn)行做4個(gè)梯度的稀釋?zhuān)總€(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)）后涂布于含氯氰菊酯的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落后，按照菌落形態(tài)、大小、顏色不同挑取單菌落在含氯氰菊酯的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板上劃線分離，純化菌株，直到得到單一、均勻的單菌落。

1.2.2 ?紫外分光光法初步鑒定高效降解菌株 ?將篩選得到的生長(zhǎng)良好的單菌落接入3 mL液體富集培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)。按3%的接種量將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)接到含100 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)至OD600 nm=0.6左右，7 000 r/min、5 min離心收集菌體。并用磷酸緩沖液洗兩次。用磷酸緩沖液懸浮菌體，并調(diào)OD600 nm=1.0。按3%的接種量接種到5瓶10 mL的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（氯氰菊酯濃度為100 mg/L）培養(yǎng)，以不加菌為對(duì)照，1、3 d 取樣，每個(gè)樣做3個(gè)重復(fù)，以三氯甲烷為萃取劑雙倍體積萃取。三氯甲烷萃取后用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于200～700 nm波長(zhǎng)下掃描確定氯氰菊酯的特征吸收峰，檢測(cè)氯氰菊酯的降解情況，以確定降解效果最好的菌株。

1.2.3 ?高效降解菌株降解率的確定 ?將降解效率最高的菌株按與“1.2.2”基本相同的步驟操作，其中氯氰菊酯的含量為10 mg/L，取樣點(diǎn)為1 、3 、5 、7 、9 d。最后用環(huán)己烷雙倍體積萃取氯氰菊酯，無(wú)水硫酸鈉除去樣品中的水，每個(gè)樣做3個(gè)重復(fù)，用氣相色譜檢測(cè)氯氰菊酯的含量。

氣相色譜條件[5]：氣相色譜儀為7 890A（帶工作站），載氣：99.999%N2，平均線速度：65 cm/L，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL ，毛細(xì)管柱（30 mm×0.53 mm× 1.5 μm）。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，ECD檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為300 ℃，柱溫采用程序升溫：初溫為150 ℃升溫至280 ℃，在此溫度保持10 min。

1.2.4 ?高效降解菌生長(zhǎng)曲線的繪制 ?將對(duì)氯氰菊酯降解率最高菌株富集后按1%的接種量接種到含0.01%的Yeast extract的液體基礎(chǔ)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30 ℃、170 r/min培養(yǎng)，0、1、3、5、7 、9 d取樣，測(cè)定其相應(yīng)的OD600 nm，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液OD600 nm為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 ?氯氰菊酯降解菌的鑒定

1）染色。常規(guī)染色觀察菌株的形態(tài)學(xué)特征，革蘭氏染色檢測(cè)參照文獻(xiàn)[6]。

2）16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析。將菌體接種到富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，取100 μL菌液離心，用滅菌水洗兩遍，再用100 μL滅菌水懸浮菌體，沸水中煮10 min，再放置冰上5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清作為模板直接PCR。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：rTaq 酶（5 U/μL） 0.2 μL，10×PCR buffer（Mg2+ Plus）2.5 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，上清液 2 μL，上游引物 0.3 μL，下游引物 0.3 μL，滅菌水 17.7 μL。

PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min30 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 8 min。

將PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，將條帶單一，清晰的PCR產(chǎn)物切膠回收。將回收片段與pGEM–T Easy載體于4 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞。隨即挑取幾個(gè)轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒，酶切檢測(cè)。將含有目的條帶的轉(zhuǎn)化子送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

3）生理生化鑒定。為明確菌株的生理生化特性，對(duì)菌株作了以下試驗(yàn)：碳源利用試驗(yàn)，產(chǎn)酸試驗(yàn)，產(chǎn)H2S試驗(yàn)，淀粉水解試驗(yàn)，甲基紅試驗(yàn)，明膠液化試驗(yàn)，V.P.試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)。試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[6]。

1.2.6 ?菌株對(duì)抗生素的敏感性 ?將菌株用富集培養(yǎng)基培養(yǎng)后，取10 μL接入含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，觀察菌株在抗生素種類(lèi)和濃度的敏感性。其中，抗生素的濃度分別為氨芐青霉素60 、20、10 μg/mL;卡那霉素50、10、2 μg/mL;鏈霉素50、10、2 μg/mL;氯霉素100、25、5 μg/mL。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?氯氰菊酯降解菌的篩選

從生產(chǎn)氯氰菊酯的工廠附近采集樣品，以氯氰菊酯為惟一碳源、氮源篩選具有降解農(nóng)藥能力的微生物。通過(guò)在含有氯氰菊酯的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中反復(fù)馴化以及無(wú)機(jī)鹽平板上多次劃線分離、純化，初步得到9株降解氯氰菊酯的菌株。為維持降解菌降解能力的穩(wěn)定性，后經(jīng)進(jìn)一步的復(fù)篩，將篩選得到的9株降解菌經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)、涂布含氯氰菊酯的無(wú)機(jī)鹽平板，得到3株生長(zhǎng)良好的降解菌。經(jīng)紫外掃描分析，氯氰菊酯在278 nm處有最大吸收峰，確定一株高效降解氯氰菊酯的菌株，命名為DZS-3。圖1為3 d內(nèi)菌株DZS-3對(duì)氯氰菊酯降解情況及對(duì)照的紫外掃描圖。

2.2 ?DZS-3對(duì)氯氰菊酯的降解率及降解趨勢(shì)

氯氰菊酯降解率=[1-（實(shí)測(cè)殘量/對(duì)照樣實(shí)測(cè)殘量）]×100%[7]。

氣相色譜的靈敏度較高，為精確計(jì)算高效降解菌DZS-3的降解率，實(shí)驗(yàn)室用氣相色譜檢測(cè)了氯氰菊酯的含量。氯氰菊酯經(jīng)DZS-3作用3 d后，DZS-3對(duì)氯氰菊酯的降解率為65.7%。圖2為經(jīng)氣相色譜檢測(cè)，DZS-39在9 d內(nèi)對(duì)氯氰菊酯的降解情況。

由圖2可以看出，前3 d DZS-3對(duì)氯氰菊酯的降解速率較快，3 d后降解逐漸變緩慢。可能是氯氰菊酯在降解的過(guò)程中產(chǎn)生了對(duì)其自身降解有抑制作用的中間產(chǎn)物。

2.3 ?高效降解菌生長(zhǎng)曲線

該菌體的生長(zhǎng)曲線（圖3）與常規(guī)的生長(zhǎng)曲線不同，一般生長(zhǎng)曲線包括滯后期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期，而該菌的生長(zhǎng)曲線沒(méi)有穩(wěn)定期?？赡苁锹惹杈挣ピ诮到獾倪^(guò)程中產(chǎn)生了某些嚴(yán)重抑制DZS-3生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，使菌體細(xì)胞迅速死亡裂解。

2.4 ?氯氰菊酯降解菌的鑒定

2.4.1 ?氯氰菊酯降解菌DZS-3的形態(tài)特征 ?通過(guò)簡(jiǎn)單染色、革蘭氏染色等生物學(xué)技術(shù)初步鑒定DZS-3降解菌的形態(tài)特征。菌落為針尖狀，表面光滑，無(wú)顏色，有輕微的氣味，顯微鏡下形狀呈短桿狀。經(jīng)革蘭氏染色鑒定，DZS-3為革蘭氏陰性菌。

2.4.2 ?16S rDNA同源性比較 ?為了確定降解菌的種類(lèi)，采用比較常用的分類(lèi)學(xué)指標(biāo)——16S rDNA序列同源性比較。

通過(guò)菌落PCR擴(kuò)增16S rDNA，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小如圖4所示。將擴(kuò)增得到的16S rDNA片段的測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S rDNA序列進(jìn)行對(duì)比，菌株DZS-3與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌PSM-2的16S rDNA一致性達(dá)到99%，將其初步鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬的一種。

應(yīng)用序列比對(duì)軟件ClustalX 1.8軟件對(duì)菌株的16S rDNA序列與相似性較高的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件Mega 5.03構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，DZS-3系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖5。

2.4.3 ?DZS-3生理生化特性 ?DZS-3生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1結(jié)果與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的模式菌株ATCC13637的特性除少數(shù)不同外基本上一致，模式菌株不能產(chǎn)酸，可以液化明膠，DZS-3可以產(chǎn)酸但不能液化明膠。

2.5 ?菌株對(duì)抗生素的敏感性

為明確DZS-3對(duì)各種抗生素的敏感性，對(duì)氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素、氯霉素等4種抗生素做了抗性試驗(yàn)。每種抗生素做了3個(gè)不同濃度梯度， DZS-3在加有不同濃度抗生素氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素的LB培養(yǎng)基中均表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，但是在氯霉素中不能生長(zhǎng)。表明DZS-3在試驗(yàn)濃度內(nèi)對(duì)氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素都有抗性，對(duì)氯霉素敏感。由于DZS-3對(duì)多種抗生素具有抗性，這將影響其以后在環(huán)境中釋放和應(yīng)用。

3 ?討論

氯氰菊酯在水中的溶解度非常低（大約0.1 mg/L），所以氯氰菊酯在使用前通常將其溶解在有機(jī)溶劑（如乙醇、正己烷）中以增加其溶解度。在篩選降解菌的過(guò)程中為防止篩選到的降解菌利用溶劑為碳源、氮源生長(zhǎng)，采用乙醇和正己烷交替使用。通過(guò)反復(fù)的初篩和復(fù)篩，從生產(chǎn)氯氰菊酯的農(nóng)藥廠污水曝氣處理池活性污泥中分離篩選一株氯氰菊酯的高效降解菌DZS-3，通過(guò)氣相色譜分析其3 d內(nèi)對(duì)10 mg/L的氯氰菊酯的降解率為65.7%。經(jīng)形態(tài)學(xué)研究及革蘭氏染色，該菌屬于革蘭氏陰性菌，菌落為針尖狀，表面光滑，顯微鏡下呈短桿狀。經(jīng)16S rDNA序列同源性分析及生理生化特性鑒定，將其鑒定為寡養(yǎng)單胞菌屬的一種。

在對(duì)降解菌初篩時(shí)，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定氯氰菊酯的含量，以氯仿為萃取劑，而氯仿本身對(duì)細(xì)胞膜有一定的破壞作用，在氯仿的作用下導(dǎo)致降解菌DZS-3細(xì)胞膜的破損，細(xì)胞內(nèi)容物如蛋白質(zhì)等滲透出來(lái)，被氯仿萃取出來(lái)，同時(shí)蛋白質(zhì)的特征吸收峰在280 nm，與氯氰菊酯的特征吸收峰278 nm靠得很近，蛋白質(zhì)的存在可能會(huì)影響氯氰菊酯的特征吸收，故使用分光光度儀只能粗略判定氯氰菊酯的降解情況。氣相色譜靈敏度較高，測(cè)定的數(shù)據(jù)能真實(shí)反映物質(zhì)的含量，要精確計(jì)算氯氰菊酯的降解率需采用氣相色譜法準(zhǔn)確測(cè)定氯氰菊酯的含量。

國(guó)內(nèi)報(bào)道的氯氰菊酯降解菌株主要有紅球菌（Rhodococcus sp.）[5]，假單胞菌（Pseudomonas sp.）[8，9，10，11]，腸桿菌Enterobacter sp.[9]，中華根瘤菌（Sinorhizobium sp.）[12]，克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）[13]，芽孢桿菌（Bacillius sp.）[14]，產(chǎn)堿菌（Alcaligenes sp.）[15]，Starkeya sp.[16]，蒼白桿菌（Ochrobactrum sp.）[17]。國(guó)外報(bào)道的氯氰菊酯的降解菌株P(guān)seudomonas sp.和Serratia sp. 20 d的降解率只有50%[18]，明顯低于本研究分離的菌株DZS-3，分離篩選的這株菌屬于寡養(yǎng)單胞菌屬，大多屬于不可培養(yǎng)微生物，與上述各個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的氯氰菊酯降解菌不同。菌株DZS-3對(duì)多種抗生素具有抗性，所以不能直接釋放入環(huán)境用于污染環(huán)境的修復(fù)，但可以作為出發(fā)菌株研究氯氰菊酯降解相關(guān)酶基因，并且有可能克隆得到新的降解基因。

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