施渺筱，郭博愷，萬(wàn)科，叢銘，張傳萍，李祝*

（1.貴州省安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州安順561000；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所，貴州貴陽(yáng)550025）

抑制煙草黑脛病的混合菌株優(yōu)化

施渺筱1，郭博愷2，萬(wàn)科2，叢銘2，張傳萍2，李祝2*

（1.貴州省安順學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州安順561000；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所，貴州貴陽(yáng)550025）

通過(guò)正交試驗(yàn)篩選混合菌株有效抑制煙草黑脛病病原菌（Phytophthora parasitica）菌絲的生長(zhǎng)，其中1107、1205、1601、5801和7403五株芽孢桿菌（Bacillus）在室內(nèi)NYBD培養(yǎng)基上培養(yǎng)，參照5因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行混菌比例優(yōu)化。結(jié)果表明，1107菌株在生物量和抑菌活性方面都表現(xiàn)出了顯著性。5株芽孢桿菌（1×108CFU/mL）的最優(yōu)組合為芽孢菌株1107、7403、1601、5801的添加量均為1.2 mL，芽孢菌株1205添加量為0.6 mL。在此優(yōu)化條件下，生物量（OD600nm值）為3.18±0.02，抑菌圈直徑為（24.22±0.68）mm，分別比單獨(dú)培養(yǎng)的菌株或其他混合菌株都顯著提高。

煙草黑脛病原菌；生物量；正交試驗(yàn)；抑菌活性

煙草黑脛病[Phytophthoraparasiticavar.nicotianae（Breda de Hean）Tuker]是引起煙草黑脛病的唯一病原菌，在自然條件下寄主范圍廣泛[1-2]，嚴(yán)重危害作物的生長(zhǎng)。煙草黑脛病是煙草生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的土傳病害之一，在我國(guó)云貴川三大煙區(qū)均有不同程度發(fā)生，而且每年的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)億元，僅次于煙草病毒病[3]。由于該病菌的游動(dòng)孢子形成快且數(shù)量大，侵染煙株后潛育期短、發(fā)病快，在一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)可以發(fā)生多次再侵染，同時(shí)該病有時(shí)還與其他病害混合發(fā)生，從而導(dǎo)致一些抗黑脛病品種抗性的喪失[4]。前人已對(duì)煙草黑脛病發(fā)生的預(yù)測(cè)、抗病品種的選育、輪作、化學(xué)防治等方面進(jìn)行了大量研究，取得了一定成效[5-8]。生產(chǎn)上用來(lái)防治煙草黑脛病的化學(xué)藥劑以甲霜靈和乙磷鋁為主[9]。根據(jù)有關(guān)報(bào)道，在大田中大面積且長(zhǎng)期重復(fù)性地大量使用同一種殺菌劑或作用機(jī)制相同的幾種內(nèi)吸性殺菌劑，極其容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治效果下降[4]。生物防治安全、無(wú)污染、無(wú)公害，是對(duì)煙草上有害生物進(jìn)行綜合治理的發(fā)展方向[10]，從現(xiàn)有煙草黑脛病生物防治的研究報(bào)道來(lái)看，采用的微生物種類有細(xì)菌、真菌、病毒等，其中細(xì)菌種類較多[11]，特別是芽孢桿菌因其具有較強(qiáng)的抗逆性、容易保存顯示出巨大的生防潛力和前景。本實(shí)驗(yàn)選取篩選出來(lái)的5株芽孢桿菌（Bacillus）菌株進(jìn)行混菌培養(yǎng)試驗(yàn)，研究其對(duì)煙草黑脛病菌病原菌的拮抗作用，對(duì)植物病害生防有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

煙草黑脛病菌病原菌煙草疫霉（Phytophthora parasitica）：貴州大學(xué)生命科學(xué)院真菌資源研究所提供。

拮抗細(xì)菌：芽孢桿菌（Bacillus）菌株5株，即1107、7403、1205、1601、5801。

1.1.2 培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖2.5 g，pH 7.2。

營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，pH 7.2±0.2。

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，氯化鈉10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4。

酵母蛋白胨（yeast saccharose peptone，YSP）培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g，蔗糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：用于拮抗菌培養(yǎng)濾液制備。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，將去皮馬鈴薯切塊，加1 000 mL水煮沸30 min，用雙層紗布過(guò)濾，取濾液加葡萄糖，加水補(bǔ)足1 000 mL，pH自然。121℃滅菌30 min。

普通酵母牛肉蒸餾水培養(yǎng)基（normal yeast beaf distilled water，NYBD）培養(yǎng)基：牛肉浸膏8.0 g，酵母浸粉5.0 g，葡萄糖10.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 主要試劑

葡萄糖（分析純）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉：上海博微生物科技有限公司；牛肉膏：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；蛋白胨、酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氯化鈉：天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ECLIPSE-E100生物顯微鏡：日本Nikon公司；PHSJ-4A精密酸度計(jì)：上海大普儀器有限公司；SW-CJ-1FD凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；BS110S電子天平：北京賽多利天平有限公司；KW-1000DC電熱恒溫水槽：江蘇金壇市中大儀器廠；SHP-250電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海光都儀器設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS立式蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；759分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

分別制作NA、NB、LB、PDA、NYBD和YSP供試發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)液各30 mL分裝于100 mL三角瓶中，121℃滅菌20 min。在上述培養(yǎng)基中分別接種等量28℃、160 r/min振蕩過(guò)夜得到的拮抗細(xì)菌種子液1×108CFU/mL，28℃、160 r/min振蕩48 h，以不接種拮抗細(xì)菌種子液的培養(yǎng)液為對(duì)照，分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。于4 000 r/min條件下離心10～15 min，棄上清液。沉淀用蒸餾水洗1～2次，然后烘干至質(zhì)量恒定。

1.3.2 拮抗菌株混菌比例優(yōu)化正交試驗(yàn)

對(duì)1107、7403、1601、5801、1205五個(gè)菌株進(jìn)行相互間拮抗試驗(yàn)，檢測(cè)菌株無(wú)拮抗性，以NYBD液體培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，正交設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1，對(duì)5個(gè)拮抗細(xì)菌的3個(gè)水平接種量進(jìn)行混菌發(fā)酵，篩選拮抗效果較好的組合可進(jìn)行大田試驗(yàn)[12]。拮抗實(shí)驗(yàn)利用陳志誼等[18]的方法，各個(gè)菌株在NA斜面上生長(zhǎng)48 h后，各自移植到50 mL培養(yǎng)液中，28℃振蕩培養(yǎng)（150 r/min）36 h，拮抗菌液含菌量為1010CFU/mL，取l mL菌液加入100 mL無(wú)菌水中，振蕩搖勻，稀釋至108CFU/mL，取5 mL稀釋菌液均勻涂布在NA平板上（被測(cè)菌株）；把滅菌的直徑為5 mm濾紙片浸入另一菌株含菌量為108CFU/mL的菌液中（測(cè)試菌株），浸泡10 s，放置到帶菌的平板（被測(cè)試菌株）上，在25℃條件下培養(yǎng)48 h，測(cè)量各菌株拮抗圈的大小（所有菌株均用作被測(cè)試菌株和測(cè)試菌株），交叉測(cè)試每個(gè)處理重復(fù)3次，整個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行2次。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)分別進(jìn)行3次重復(fù)，所有數(shù)據(jù)通過(guò)K-S檢驗(yàn)（SPSS17.0）。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，菌株1107在YSP中的生長(zhǎng)最好，經(jīng)SPSS17.0分析，OD600nm值顯著大于其他NA、NB、LB和PDA 4種培養(yǎng)基；菌株7403、1205、1601和5801均在NYBD中生長(zhǎng)最好，都顯著高于其他5種培養(yǎng)基。因此，選擇NYBD作為后續(xù)培養(yǎng)基。

2.2 拮抗菌株混菌比例優(yōu)化正交試驗(yàn)

對(duì)5個(gè)拮抗菌株進(jìn)行兩兩拮抗性測(cè)試，表明它們相互之間沒(méi)有拮抗性。以NYBD作為發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)L27（35）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

由表2可知，對(duì)發(fā)酵生物量的影響大小依次為芽孢菌株1107（A）＞芽孢菌株1601（C）＞芽孢菌株1205（E）＞芽孢菌株7403（B）＞芽孢菌株5801（D）。以發(fā)酵生物量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各因素的最佳組合為A2B3C3D3E2，即芽孢菌株1107（A）0.6 mL，芽孢菌株7403（B）1.2 mL，芽孢菌株1601（C）1.2 mL，芽孢菌株5801（D）1.2 mL，芽孢菌株1205（E）0.6mL。對(duì)抑菌活性的影響大小依次為芽孢菌株1107（A）＞芽孢菌株5801（D）＞芽孢菌株1601（C）＞芽孢菌株1205（E）＞芽孢菌株7403（B）。以抗菌活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各因素的最佳組合為A2B3C3D3E3，即芽孢菌株1107（A）0.6 mL，芽孢菌株7403（B）1.2 mL，芽孢菌株1601（C）1.2 mL，芽孢菌株5801（D）1.2 mL，芽孢菌株1205（E）1.2 mL。分別對(duì)以上兩個(gè)組合進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，確定了5株芽孢桿菌的最優(yōu)組合為A3B3C3D3E2，即以NYBD作為發(fā)酵培養(yǎng)基，分別將芽孢菌株1107、7403、1601、5801（1×108CFU/mL）以1.2 mL的添加量和芽孢菌株1205（1×108CFU/mL）以0.6 mL的添加量加到40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min振蕩48 h，生物量OD600nm為3.18±0.02，抑菌圈直徑為（24.22±0.68）mm，分別比單獨(dú)培養(yǎng)的菌株或其他混合菌株都顯著提高。

由表3、表4可知，各因素對(duì)生物量、抑菌圈的影響均不顯著。

3 結(jié)論

篩選生防菌、生防病毒、生防制劑以及植物性提取物是防治煙草黑脛病的一種安全、有效途徑[9]。叢銘等[17]分離到的蠟樣芽孢桿菌抑制黑脛病效果達(dá)到（20.5±0.19）mm（含濾紙片），而本研究通過(guò)正交試驗(yàn)得到了拮抗效果最優(yōu)組合A3B3C3D3E2，即在細(xì)菌液濃度均為1×108CFU/mL條件下，芽孢菌株1107（A）1.2 mL，芽孢菌株7403（B）1.2 mL，芽孢菌株1601（C）1.2mL，芽孢菌株5801（D）1.2 mL，芽孢菌株1205（E）0.6mL。在此條件下，生物量（OD600nm）為3.18±0.02，抑菌圈直徑達(dá)到了（24.22±0.68）mm，效果更佳。

生防菌對(duì)煙草黑脛病菌的拮抗能力并不等同于防治能力，防治效果往往與制劑的劑型、生防菌劑的田間適應(yīng)能力、菌株的繁殖能力等密切相關(guān)[13]。芽孢桿菌作為目前廣泛使用的生防菌其具有抗菌物質(zhì)活性高、易于進(jìn)行分子加工等特點(diǎn)[14]，所以對(duì)于單一劑型和混合劑型的田間效果會(huì)在下一步的大田應(yīng)用研究中繼續(xù)跟進(jìn)。

近年來(lái)，用芽孢桿菌進(jìn)行土傳病害防治的例子很多，一些芽孢桿菌在防病的同時(shí)也存在促生的作用，能明顯增加作物的產(chǎn)量[15]。除此之外，芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢對(duì)化學(xué)應(yīng)激和物理應(yīng)激均有較強(qiáng)的抵抗能力，有利于它們?cè)谕寥拉h(huán)境中生長(zhǎng)增殖，適用于植物土傳病害的生物防治[16]。本研究表明混合菌種能夠比單一菌種顯著提高病害防治效果，其機(jī)理是混菌搭配產(chǎn)生的防治效果更廣，同時(shí)，混菌對(duì)黑脛病共同作用時(shí)，產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)可能與各菌株之間的協(xié)同作用有很大關(guān)系，菌株之間的相互作用可能對(duì)促進(jìn)拮抗物質(zhì)的產(chǎn)生比靠單一菌株的產(chǎn)生效果更好，該結(jié)果為推動(dòng)環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供了佐證，也為大田應(yīng)用中使用單一菌株進(jìn)行病害防治提供補(bǔ)充，但其機(jī)理需進(jìn)一步研究。

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SHI Miaoxiao1,GUO Bokai2,WAN Ke2,CONG Ming2,ZHANG Chuanping2,LI Zhu2*
(1.College of Agriculture,Anshun University,Anshun 561000,China; 2.Institute of Fungus Resources,College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Mixed strains which suppress the growth ofPhytophthora parasiticavar.nicotianae mycelial were screened by orthogonal experiment. Bacillusstrains 1107,1205,1601,5801 and 7403 were cultured in NYBD medium,and the optimal mixed strain proportion was optimized by 5 factors3 levelsorthogonalexperiment.Resultsindicated thatbiomassand bacteriostatic activityofstrain 1107 were significant.The results showed that the optimum mixed strains(1×108CFU/mL)addition wereBacillus1107 1.2 ml,Bacillus7403 1.2 ml,Bacillus1601 1.2 ml,Bacillus5801 1.2 ml,Bacillus1205 0.6 ml.Under this condition,the OD600nmwas 3.18±0.02 and the inhibition zone diameter reached(24.22±0.68)mm,greatly increased than other mixed strains and the single cultured ones.

Phytophthora parasiticavar.nicotianae;biomass;orthogonal experiments;antibacterial activity

Q939.97

A

0254-5071（2015）04-0082-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.018

2014-12-30

畢節(jié)市煙草公司項(xiàng)目（2013（03）號(hào)）；貴州省科學(xué)技術(shù)廳、安順市人民政府、安順學(xué)院聯(lián)合科技基金資金資助（黔科合J字LKA [2012]06號(hào)）

施渺筱（1971-），女，教授，博士，主要從事生物化學(xué)及微生物學(xué)研究工作。

*通訊作者：李祝（1978-），女，教授，博士，主要從事農(nóng)業(yè)微生物學(xué)研究工作。