先元華，朱玉潔，梁宗余

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化工工程系，四川宜賓644003；2.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇淮安223200）

不同固定化酵母載體對(duì)啤酒風(fēng)味成分影響研究

先元華1，朱玉潔2，梁宗余1

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化工工程系，四川宜賓644003；2.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇淮安223200）

采用氣相色譜分析法，主要考察了山毛櫸木片、多孔陶瓷和海藻酸鈉3種固定化酵母載體對(duì)啤酒風(fēng)味物質(zhì)成分的影響。結(jié)果表明，不同固定化酵母載體對(duì)啤酒風(fēng)味物質(zhì)成分的形成有較大影響，其中海藻酸鈉載體固定化酵母的牢固程度最好，且載體正丙醇、異丁醇和異戊醇含量分別高于成品啤酒9%、8%和12%，啤酒含醇量較高，適于醇厚型啤酒發(fā)酵；山毛櫸木載體生成的酯類物質(zhì)較多，載體乙酸異丁酯、乙酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯含量分別高于成品啤酒20.1%、14.3%、12.5%和17.4%，含酯量較高，適于淡爽型啤酒發(fā)酵；與另兩種載體相比，多孔陶瓷載體雙乙酰含量達(dá)到0.14 mg/L，不適合用于啤酒發(fā)酵。

固定化酵母載體；啤酒；氣相色譜；風(fēng)味物質(zhì)

風(fēng)味物質(zhì)是啤酒發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，隨著發(fā)酵工業(yè)的不斷發(fā)展，目前越來(lái)越受到人們的關(guān)注[1-2]。越來(lái)越多的企業(yè)意識(shí)到穩(wěn)定優(yōu)質(zhì)的啤酒風(fēng)味質(zhì)量是市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)中取勝的關(guān)鍵。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者使用不同載體對(duì)啤酒固定化連續(xù)發(fā)酵進(jìn)行了研究：楊秋明等[3]以海藻酸鈉，程江峰等[4-5]以陶瓷，LINKO M等[6-7]以山毛櫸木片，陳功等[8]以聚乙烯醇（PVA）與陰離子交換樹(shù)脂（苯乙烯型）混合制成的生物膜，BRANYIK T等[9]以玉米芯作為載體，石小霞等[10]以海藻酸鈉-聚乙烯醇，分別對(duì)固定化載體連續(xù)發(fā)酵啤酒進(jìn)行了深入的研究

但以上研究?jī)H局限于單一載體方面的研究且連續(xù)化程度不高，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中難免造成樣品對(duì)色譜柱污染。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用固定化酵母進(jìn)行啤酒連續(xù)后發(fā)酵，將更有利于實(shí)行規(guī)模效益，促進(jìn)啤酒生產(chǎn)的現(xiàn)代化、連續(xù)化，可以大大縮短啤酒的發(fā)酵周期。應(yīng)用頂空氣相色譜法分析啤酒風(fēng)味物質(zhì)具有樣品基體對(duì)色譜柱的污染小、譜圖簡(jiǎn)單、干擾少的優(yōu)點(diǎn)。

針對(duì)目前氣相色譜分析啤酒風(fēng)味物質(zhì)成分情況，結(jié)合啤酒生產(chǎn)工藝特點(diǎn)，采用氣相色譜分析不同固定化酵母載體對(duì)啤酒風(fēng)味成分物質(zhì)的影響，以期對(duì)企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：宜賓食品微生物工程實(shí)驗(yàn)室選育保藏；冷卻并充氧處理的11°Bx麥汁：宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院啤酒實(shí)訓(xùn)車間制備；山毛櫸木（0.8 cm× 0.5 cm×0.12 cm）、多孔陶瓷（1.0 cm×0.8 cm×0.6 cm）：市場(chǎng)購(gòu)買。

正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯均為色譜純：天津益仁達(dá)化工有限公司；海藻酸鈉、氯化鈣為分析純：濟(jì)南科旭化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

固定床反應(yīng)罐（容積為10 L，徑高比為1∶4，帶有夾套）：自制；GC-6890氣相色譜帶火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）：美國(guó)安捷倫公司；HP-INNOWax毛細(xì)管柱（0.53 mm×0.25 μm×30 m）：美國(guó)安捷倫公司；HP氣相色譜化學(xué)工作站、SGH-300高級(jí)氫發(fā)生器、HP7694E頂空自動(dòng)進(jìn)樣器：美國(guó)安捷倫公司；UV-2401PC紫外分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化酵母載體的制備

海藻酸鈉載體制備[10]：海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、酵母液與海藻酸鈉包埋比例為1∶6和固定化凝膠珠填充量17.5 g/100 mL。

山毛櫸木片和多孔陶瓷載體制備：兩種載體分別經(jīng)沸水蒸煮4 h，取出后浸入體積分?jǐn)?shù)為10%乙醇中2 h，然后取出載體再在沸水中蒸煮1 h。取20 g經(jīng)上述處理后的濕山毛櫸木片（或多孔陶瓷）加入250 mL三角瓶中，向三角瓶中加入濃度為5×106個(gè)/mL的酵母液200 mL，用封口膜封口，固定吸附溫度為20℃，搖床轉(zhuǎn)速為80 r/min，固定時(shí)間為12 h。

1.3.2 發(fā)酵方法

取第5天的主發(fā)酵液，經(jīng)3 000 r/min離心10 min后，然后用80℃水浴加熱10 min，快速冷卻至室溫，在自制反應(yīng)器中溫度為10℃條件進(jìn)行固定化發(fā)酵，滯留時(shí)間為10 h[11]。

1.3.3 載體固定酵母量的測(cè)定

在600 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度值[12-13]，通過(guò)酵母標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出三角瓶液體中的酵母濃度，從而可知載體上酵母數(shù)量。

1.3.4 風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)方法

樣品預(yù)處理：發(fā)酵液以5000r/min的速度離心10 min，取5 mL上清液經(jīng)反復(fù)過(guò)濾后置于20 mL頂空瓶中，自動(dòng)進(jìn)樣。

標(biāo)樣配制[14]：以體積分?jǐn)?shù)為20%乙醇作為溶劑，于100mL容量瓶中準(zhǔn)確添加異戊醇0.30mL、正丙醇0.08mL、異丁醇0.08 mL、正丁醇5 μL、乙酸乙酯0.08 mL、乙酸異戊酯10 μL、己酸乙酯2 μL、辛酸乙酯2 μL、甲酸乙酯1 μL、乙酸異丁酯0.5 μL。另配1%的二甲基硫溶液10 mL，以體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇作基質(zhì)，加二甲基硫0.1 mL，混勻后準(zhǔn)確移取此溶液0.05 mL至上述混標(biāo)中。

氣相色譜條件：柱溫起始溫度為50℃，以10℃/min程序升溫至160℃；進(jìn)樣器溫度為100℃；檢測(cè)器溫度為300℃；載氣為高純N2，流速為4 mL/min；H2速度為30mL/min；空氣為400 mL/min；采用分流進(jìn)樣，分流比為2∶1。

檢測(cè)方法：采用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定，在啤酒樣品頂空瓶中準(zhǔn)確加入0.10 mL標(biāo)樣溶液，加密封墊和鋁帽壓緊，輕搖頂空瓶使之混勻，此為測(cè)定校正因子時(shí)的樣品配制方法，作組分定性時(shí)加單一標(biāo)準(zhǔn)液，實(shí)樣測(cè)定時(shí)不加標(biāo)液。將樣品瓶置于頂空自動(dòng)進(jìn)樣器中，進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在600 nm波長(zhǎng)條件下測(cè)定吸光度值，以酵母濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制酵母標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，在酵母濃度為0～2.5×105個(gè)/mL的范圍內(nèi)，酵母濃度與吸光度值呈正比例關(guān)系，酵母標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.184 6x+0.001，相關(guān)系數(shù)R2為0.995 7，表明二者線性關(guān)系良好。

2.2 載體固定酵母量及牢固程度比較

載體對(duì)酵母量的固定和牢固程度直接影響啤酒風(fēng)味的形成。圖2顯示了海藻酸鈉、多孔陶瓷和山毛櫸木3種載體的固定酵母量及牢固程度。

由圖2可知，海藻酸鈉載體固定酵母量最高，生物載荷量達(dá)到1.83×107個(gè)/g。隨著振蕩時(shí)間的延長(zhǎng)，載體上振蕩下來(lái)的酵母量逐漸增多，0～1 min期間，海藻酸鈉載體振蕩下來(lái)的酵母量最低，這說(shuō)明海藻酸鈉包埋固定酵母細(xì)胞牢固能力優(yōu)于多孔陶瓷載體和山毛櫸木載體的固定能力；在1～4 min時(shí)間內(nèi)，多孔陶瓷載體和山毛櫸木載體振蕩下來(lái)的酵母量基本相同；而4 min時(shí)海藻酸鈉載體仍固定著較多酵母。因此海藻酸鈉載體固定化酵母的量最多，牢固程度最好。

2.3 載體對(duì)酯類物質(zhì)含量的影響

酯類物質(zhì)的含量影響啤酒的香味，從而影響啤酒生成的類型。圖3和表1顯示了海藻酸鈉、多孔陶瓷載體和山毛櫸木3種載體啤酒后發(fā)酵過(guò)程酯類物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)效果。

由圖3和表1可知，與主酵液相比，3種載體啤酒后發(fā)酵過(guò)程中酯類物質(zhì)均有所下降，說(shuō)明啤酒后發(fā)酵正常。成品啤酒乙酸異丁酯和乙酸乙酯生產(chǎn)量分別為0.005 mg/L和 10.11 mg/L。山毛櫸木載體生成的乙酸異丁酯、乙酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯分別高于成品啤酒20.1%、14.3%、12.5%和17.4%，說(shuō)明山毛櫸木載體生成的酯類物質(zhì)較多，適合于淡爽型啤酒發(fā)酵。

2.4 載體對(duì)醇類物質(zhì)含量的影響

醇類是啤酒花香氣的重要成分，對(duì)啤酒香氣質(zhì)量產(chǎn)生直接影響。圖4顯示了海藻酸鈉、多孔陶瓷載體和山毛櫸木3種載體對(duì)醇類物質(zhì)的影響情況。

由圖4可知，成品啤酒正丙醇、異丁醇和異戊醇生成量分別為9.45 mg/L、10.34 mg/L和26.31 mg/L。山毛櫸木載體和多孔陶瓷載體醇類物質(zhì)含量均低于成品啤酒。海藻酸鈉載體生成的正丙醇、異丁醇和異戊醇分別高于成品啤酒9%、8%和12%，說(shuō)明海藻酸鈉生成的醇類物質(zhì)較多，適合于醇厚型啤酒發(fā)酵。

2.5 載體對(duì)乙醛物質(zhì)含量的影響

啤酒中存在乙醛影響著口味的成熟，啤酒中乙醛的閥值為10 mg/L[15]。乙醛含量超過(guò)閥值時(shí)，啤酒會(huì)給人一種粗糙苦味感覺(jué)；乙醛含量過(guò)高時(shí)，啤酒有一種辛辣、腐爛的青草味或青蘋(píng)果味。圖5顯示了海藻酸鈉、多孔陶瓷載體和山毛櫸木3種載體對(duì)乙醛物質(zhì)的影響情況。

由圖5可知，成品啤酒乙醛生成量為6.53 mg/L，海藻酸鈉、多孔陶瓷載體和山毛櫸木三種載體后發(fā)酵過(guò)程乙醛的生成量分別為6.54 mg/L、6.53 mg/L、6.56 mg/L，說(shuō)明載體的性質(zhì)對(duì)啤酒中乙醛的含量沒(méi)有太大影響。

2.6 載體對(duì)雙乙酰物質(zhì)含量的影響

雙乙酰的含量決定成品啤酒的品質(zhì)。圖6顯示了海藻酸鈉、多孔陶瓷載體和山毛櫸木3種載體啤酒后發(fā)酵生產(chǎn)啤酒中的雙乙酰情況。

由圖6可知，海藻酸鈉、山毛櫸木作為載體后發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒中雙乙酰含量與成品啤酒相差不大，為0.12 mg/L左右；以多孔陶瓷作為載體后發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒中雙乙酰含量最高，達(dá)到0.14 mg/L。雙乙酰含量超標(biāo)會(huì)給啤酒帶來(lái)不愉快的餿飯味，這可能是由于多孔陶瓷載體上酵母量最低，從而降低了雙乙酰的還原效率。因此多孔陶瓷載體不適合用作啤酒發(fā)酵。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：海藻酸鈉固定酵母量最高，生物載荷量達(dá)到1.83×107個(gè)/g，從而導(dǎo)致啤酒雙乙酰含量最低。多孔陶瓷固定酵母量最低，降低了雙乙酰的還原效率，導(dǎo)致發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒中雙乙酰含量高達(dá)到0.14 mg/L，不適合用作啤酒發(fā)酵。與主酵液相比3種載體啤酒后酵過(guò)程中酯類物質(zhì)均有所下降，說(shuō)明啤酒后發(fā)酵正常。山毛櫸木載體生成的酯類物質(zhì)較多，載體乙酸異丁酯、乙酸乙酯、乙酸異戊酯和己酸乙酯生產(chǎn)量分別高于成品啤酒20.1%、14.3%、12.5%和17.4%，含酯量較高，適合于淡爽型啤酒發(fā)酵使用。海藻酸鈉載體固定化酵母的牢固程度最好，且載體正丙醇、異丁醇和異戊醇生產(chǎn)量分別高于成品啤酒9%、8%和12%，啤酒含醇量較高，適合于醇厚型啤酒發(fā)酵。

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XIAN Yuanhua1,ZHU Yujie2,LIANG Zongyu1
（1.Biological and Chemical Engineering Department of Yibin Vocational and Technical College,Yibin 644003,China; 2.biological and Chemical Engineering Institute of Jiangsu Food and Drug of Career Technical College,Huaian,223200,China）

The effect of three kinds of immobilized yeast carriers(beech wood,porous ceramics and sodium alginate)on beer flavor composition was analyzed by gas chromatography.The results showed that different carriers had great impact on the formation of the beer flavor,sodium alginate immobilized yeast was the optimal,and the production of the carrier of n-propyl alcohol,isobutyl alcohol and isoamyl alcohol were 9%,8%and 12% higher than the finished beer.The alcohol content of beer was high,which was suitable for mellow beer fermentation.Beech carrier generated more esters.The carrier of isobutyl acetate,ethyl acetate,isoamyl acetate and ethyl caproate content was 20.1%,14.3%,12.5%and 17.4%higher than the finished beer,respectively.The ester content was high,which was suitable for light beer fermentation.Compared with the other two kinds of carriers, porous ceramic carrier diacetyl content reached 0.14 mg/L,not suitable for beer fermentation.

immobilized yeast carrier;beer;gas chromatography;flavor substances

Q81

A

0254-5071（2015）04-0047-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.011

2015-02-27

四川省自然科學(xué)基金（2013NY028）

先元華（1967-），男，副教授，碩士，主要從事環(huán)境工程研究工作。