撒煥蘭 馬克威

(吉林大學第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

橫紋肌肉瘤發(fā)病機制的研究進展

撒煥蘭 馬克威

(吉林大學第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

軟組織腫瘤；橫紋肌肉瘤；融合基因；分子通路；靶向治療

橫紋肌肉瘤(RMS)是兒童軟組織腫瘤中最常見的一種惡性腫瘤，約占兒童所有惡性腫瘤的3%〔1〕。2013年WHO制定的軟組織與骨腫瘤分類中將RMS分為：胚胎性橫紋肌肉瘤(ERMS)，腺泡狀橫紋肌肉瘤(ARMS)，多形性橫紋肌肉瘤(PRMS)及梭形細胞/硬化性橫紋肌肉瘤。在診斷為RMS的病例中，ERMS約占60%，ARMS約占20%，其余分型占20%。不同類型橫紋肌肉瘤的組織學特點、遺傳學特點、發(fā)病部位、年齡和預后不同〔2〕，染色體異常和分子通路的改變往往是橫紋肌肉瘤發(fā)病的主要原因，它們與其治療方案的選擇和預后評估有重要關系。

1 染色體異常

腫瘤的發(fā)生過程中大部分伴隨有染色體數(shù)目和結構異常。細胞遺傳學和分子生物學研究發(fā)現(xiàn)，80%的ARMS具有特征性染色體易位t(2；13)(q35；q14)(60%～70%) 和t(1；13)(p36；q14)(10%)，分別形成PAX3-FOXO1和PAX7-FOXO1融合基因〔3〕。PAX3-FOXO1或PAX7-FOXO1融合體基因由PAX3 或PAX7的5′外顯子與FKHR的3′外顯子融合而成，其形成的融合基因編碼新的轉錄因子由PAX3或PAX7的DNA 結合域與FKHR 轉錄活化結構域構成〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)在個別ARMS病例中存在由t(2；X)(q35；q13)形成的PAX3-AFX和由t(2；2)(q35；p23)、t(2；8)(q35；q13) 易位分別形成的PAX3-NCOA1、PAX3-NCOA2融合基因〔5〕。在ARMS中也存在11號染色體短臂(11 p15.5)雜合性缺失(LOH)，Davicioni 等〔6〕研究顯示，LOH在融合基因陰性的RMS中發(fā)生率為77%，而融合基因陽性RMS中LOH的發(fā)生率僅為24% ?；驍U增在ARMS中也常見，其中三種最常見的擴增涉及2、12、13號染色體。

ERMS是RMS中發(fā)病率最高的一種類型，臨床預后比ARMS好。80%的ERMS有11號染色體短臂(11 p15.5)雜合性缺失，提示有抑癌基因失活〔3〕。隨后，Kapels等〔7〕在ERMS中發(fā)現(xiàn)了der(16)t(1；16) 易位。Sirvent等〔8〕用原位免疫熒光證實了在ERMS中存在t(4；22)(q35；q12)易位。Calabrese等〔9〕在一個被診斷為葡萄簇狀ERMS的2歲小女孩病例中發(fā)現(xiàn)了t(8；11)(q12～13；q21)易位。ERMS中也存在染色體的擴增，以2、7、8、11、12、13、19和20號染色體擴增較為常見〔10〕。

2 分子通路改變

由于ERMS和ARMS表達基因的不同，導致ARMS較 ERMS預后差，其中PAX3-FOXO1是ARMS中最常見的融合基因，該融合基因編碼轉錄激活子，通過異常驅動多種基因的表達促進腫瘤的發(fā)生。與PAX3-FOXO1特異性表達相關的主要靶標改變包括FGFR4、JARID2、N-MYC、MET、CXCR4和CNR1；還有一些獨立于PAX3-FOXO1的分子通路的改變，如RAS信號通路、YAP1信號通路和miRNAs。

這里利用SPSS的繪圖過程看似比較煩瑣，然而這個恢復原始數(shù)據、編碼，然后再制圖的一系列過程，卻可充分調動學生手腦并用參與其中的積極性。在制作統(tǒng)計圖的過程中，學生可漸進式深度消化統(tǒng)計學中的變量及其類型、數(shù)據及其類型以及頻數(shù)與頻數(shù)分布等有關概念的含義，同時也能對利用統(tǒng)計方法處理、分析數(shù)據的流程有更為深刻的認識。

迄今為止，許多因素已經確定可以促進ARMS腫瘤的發(fā)展。PAX3-FOXO1是一種多效的融合蛋白，可通過FGFR4、JARID2、N-MYC、MET、CXCR4發(fā)揮促進細胞增殖和侵襲的作用，通過BCL、N-MYC途徑抑制細胞凋亡和通過JARID2通路抑制終末分化。

PAX3-FOXO1能夠抑制細胞凋亡，反義寡核苷酸下調野生型PAX3或PAX3-FOXO1均可誘導RMS細胞凋亡，其抗凋亡活性與Bcl-XL途徑有關。進一步研究表明，PAX3-FOXO1可導致Bcl-XL mRNA水平升高，同時Bcl-XL可拮抗反義PAX3-FOXO1 所誘發(fā)的細胞凋亡〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)，融合蛋白的與Bcl-XL促進子結合并刺激Bcl-XL基因的轉錄，表明Bcl-XL是融合蛋白的直接靶標〔5〕。

PAX3-FOXO1具有促進細胞增殖的作用，Kikuchi等〔11〕在ARMS的Rh30細胞系中用siRNA敲除PAX3-FOXO1融合基因后細胞的增殖減少。Collins等〔12〕用免疫組織化學技術研究表達PAX3-FOXO1陽性的ARMS樣本也證實了這一觀點。

2012年，Marshall等〔14〕發(fā)現(xiàn)PAX3-FOXO1通過下游的增強子可以上調FGFR4的表達。成纖維細胞生長因子受體(FGFR)與其配體FGF結合后將信號傳遞到胞內，通過激活Ras通路及其下游的PI3K/Akt通路或MAPK/PKC通路等通路發(fā)揮其生物學效應，比如調控細胞的增殖、分化、生長、血管形成和遷移〔15〕。Marshall等〔14〕分別用WT-FGFR4和CA-FGFR4轉染肌母細胞發(fā)現(xiàn)只有CA-FGFR4可導致細胞增殖增強，提示FGFR4的突變可能導致RMS的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)7.5%的RMS患者存在FGFR4突變，其與臨床分期和不良預后密切相關〔16〕。目前已成功研制出許多非常有前景的FGFR酪氨酸激酶抑制劑，還有一些尚停留在早期的臨床試驗階段。

留給ofo的時間已經不多。11月14日，久未露面的戴威在已經很久沒有舉行的ofo公司大會上表示：除了破產，其他都有可能。

（1）中國對 “一帶一路”沿線國家機械運輸設備產品出口的種類比較豐富，且在各國的分布差異在逐步縮小。從圖1中可以看到，2007～2017年，擴展邊際的核密度圖峰值均接近于1，基本在 （0.9～1）之間，這說明中國在 “一帶一路”沿線國家的出口種類比較齊全。2007～2012年，核密度圖的峰值越來越高且曲線位置微微右移，說明中國對 “一帶一路”沿線國家的出口產品種類差距越來越??；由于2012～2016年機械行業(yè)市場低迷，所以核密度圖的峰值波動下降，意味著各國的擴展邊際差距稍有變化，但變化幅度并不大。2017年核密度圖的峰值稍有升高，機械行業(yè)市場稍有回暖。

N-Myc和融合蛋白PAX3/7-FOXO1在ARMS的生物學作用中起協(xié)同效應，MYCN是PAX3-FOXO1下游的直接靶基因〔19〕。一個大樣本的研究發(fā)現(xiàn)55%的RMS患者N-Myc過表達，其中融合基因陽性的ARMS患者為76%(41/54)，ERMS患者為45%(70/155)N-Myc過表達的患者臨床預后差(P=0.012)〔20〕且更容易復發(fā)〔21〕。用N-Myc特異性抗原agPNA(PNA-MYCN)沉默N-Myc的表達后，細胞增殖減少且凋亡增加〔20〕。沉默MYCN的表達也會抑制一系列與癌癥相關基因的表達，包括與肌形成和細胞增殖功能相關的基因，例如PLK4(Polo-like-kinase-4的下降(主要調節(jié)中心粒的形成，與中心體的擴增有關)〔22〕，與Taylor等〔16〕的觀點一致。

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2.2.2 YAP信號通路的活化 2014年，Tremblay等〔35〕發(fā)現(xiàn)YAP1和Hippo通路在ERMS中發(fā)揮著抑制分化和促進細胞增殖的作用。核內YAP1主要通過共同激活TEAD轉錄因子家族形成YAP1-TEAD復合物發(fā)揮作用。研究表明在C2C12成肌細胞和培養(yǎng)的激活的衛(wèi)星細胞中，YAP1的S127A的突變可促使細胞增殖和抑制終末性分化〔36〕。Tremblay等〔35〕發(fā)現(xiàn)高活性的YAP1可以導致小鼠ERMS樣腫瘤，相比于其他的RMS小鼠模型有更短的發(fā)病時間和高外顯率，因此確定YAP1是ERMS一個非常強大的驅動基因。YAP1還可能介導促進與RMS有關的很多癌基因的表達(如Myc，Met，Rras2，Maff，Ras，Birc5/Survivin)。YAP1抑制分化的機制是影響MYOD1和MEF2在骨骼肌分化位點上的結合和上調肌源性轉錄因子抑制劑的表達〔37〕。因此YAP1是通過上調致癌基因以及抑制分化促進ERMS的形成。

大麻素受體(CNR1)經過ChIP技術分析證實是PAX3-FOXO1 融合基因的靶標〔25〕，其在PAX3-FOXO1 融合基因陽性的ARMS細胞中的mRNA和蛋白表達水平均特異性增高〔26〕。CNR1已經被提出作為ARMS的潛在藥物治療靶點，同時CNR1激動劑可以在ARMS的一些細胞系中誘導細胞的凋亡〔27〕。

2.1 PAX3/PAX7-FOXO1致癌活性與靶標 PAX-FOXO1融合蛋白是一種高效的腫瘤特異性轉錄因子，具有轉錄激活的功能。ARMS中PAX3-FOXO1和PAX7-FOXO1的mRNA表達水平均比野生型PAX3和PAX7高，這表明融合基因過表達是ARMS的特征之一。但是PAX3-FOXO1和PAX7-FOXO1過表達機制不同：PAX7-FOXO1是由基因擴增所致，而PAX3-FOXO1則是由于順式作用元件使轉錄活性增加所致。PAX-FOXO1的高表達可誘導雞胚纖維母細胞和鼠類NIH3T3細胞發(fā)生致癌性轉化，但是如果只有PAX-FOXO1改變通常不足以發(fā)生完全致癌性轉化，這表明RMS的形成還需要其他遺傳學改變(如Trp53或Cdkn2a的抑制)的支持。

(3)由于半參數(shù)估計模型能夠兼顧“參數(shù)”和“非參數(shù)” 2類因素，因此能得到較為準確的估計量，且采用半參模型的解算方法比傳統(tǒng)最小二乘法精度更高。

2014年，Walters等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)JARID2是PAX3-FOXO1融合蛋白的直接靶點，可抑制橫紋肌肉瘤細胞的肌源性分化。在RH30細胞系中，用PAX3-FOXO1特異性siRNA沉默PAX3-FOXO1融合基因的表達，用 RT-PCR技術和Western印跡技術分析發(fā)現(xiàn)JARID2的RNA和蛋白水平均降低〔18〕。JARID2在PAX3-FOXO1融合基因陽性的ARMS中比在陰性中的表達水平顯著性增高(P<0.0001，R2=0.4293)〔18〕。用siRNA沉默JARID2的表達，流式細胞術證實了腫瘤細胞增殖減少，同時表達肌分化標志MYOG基因和MYL1蛋白增加〔17〕。

2.2.1 RAS信號通路改變 2013年，Chen 等〔28〕通過對ARMS和ERMS患者進行全基因組測序和轉錄組測序證實了在ERMS中p53和RAS通路的突變很常見。2014年，Shern等〔29〕研究發(fā)現(xiàn)NRAS、KRAS和HRAS在融合基因陰性的RMS中發(fā)生突變的頻率分別為11.7%、6.4%和4.3%，突變主要為于ERMS；另外，有報道RAS通路的突變常發(fā)生于成人的肺癌、結腸癌和胰腺癌中，增加氧化應激可以促使RAS的致瘤性〔30〕。RAS基因編碼GTP酶家族，作為第二信使調控細胞內的多種反應途徑包括增殖、分化和生存〔31〕。RAS可以激活多種絲裂原激活蛋白激酶(MAPKs)和胞外信號調節(jié)激酶(ERK)。RAS也可以直接結合到PI3K上并發(fā)動 AKT/mTOR信號轉導。mTOR/S6K1和EIF4EBP1在蛋白的合成調節(jié)中都起了很關鍵的作用〔32〕。因此RAS可以通過RAS-MAPK/ERK 和AKT/S6K1兩個主要的信號通路調控細胞的增殖。RAS信號通路也調節(jié)抗凋亡因子MDM2的表達〔33〕，Dusp4/MKP2基因可抑制ERK途徑，和轉化細胞中RAS的活化水平有關〔34〕。因此RAS蛋白通過參與多重信號轉導途徑來控制細胞增殖、分化和生存，同時可作為GDP/GTP調節(jié)的分子開關控制細胞內的信號轉導。

Assessment of geohazards susceptibility for Huachi county by the optimal combined weight

研究發(fā)現(xiàn) MET和CXCR4是PAX3-FOXO1融合蛋白的下游基因，可以上調MET和CXCR4的表達〔18〕。MET是肝細胞生長因子(HGF)的受體，CXCR4是基質細胞源性因子(SDF-1)的受體，在ARMS中，HSF和SDF-1都對腫瘤細胞向骨髓的轉移有化學趨向性〔23〕，骨髓是ARMS的常見轉移部位。用shRNA沉默RMS中MET的表達后發(fā)現(xiàn)細胞增殖減少、凋亡增加。MET和CXCR4作為PAX3-FOXO1的靶基因，其高表達與ARMS的組織學、疾病晚期的診斷和骨髓轉移有關〔24〕。

2.2 其它分子通路改變

2.2.3 P53通路的改變 P53可以調控很多涉及細胞周期調控、凋亡、衰老、DNA修復、新陳代謝等的轉錄調節(jié)因子，例如 p21Waf1/Cip1、Bax和Bcl-2。2013年，Chen 等〔28〕通過測序發(fā)現(xiàn)RMS細胞具有高頻率p53突變，其中ERMS中p53通路的突變率為19%(6/31)，ARMS中p53通路的突變率為7%(1/14)。p53通路滅活可源自于p53突變本身或其他改變，例如MDM2表達的增加(調節(jié)p53下調)、上游介質的缺失(例如CDKN2A)等。在腫瘤中P53基因的突變通常伴隨著侵襲性更強的生物學特征，因此表達突變型 p53可提示RMS預后較差〔37〕。

2.2.4 miRNAs調節(jié)異常 RMS的發(fā)生過程中最常見的miRNAs包括肌肉特異性miRNAs(miR-1、 miR-133a/b、miR-206)〔38〕和miR-29家族〔39〕。miRNAs可以直接調節(jié)肌肉調節(jié)因子(MRFs、MAPKs)，調節(jié)細胞周期的基因或生長因子依賴的信號轉導。miR-1的上調會使ERMS的細胞停滯在G1/S期，同時上調肌肉特異性基因，如肌細胞生成素(myogenin)〔40〕。miR-206高表達與肌肉的分化高度相關，其低表達與MAP激酶和NFKappaB通路激活相關，在細胞系中miR-206表達的增加可以抑制細胞生長轉移并誘導凋亡〔41〕。miR-29家族通過激活的NF-kB通路抑制RMS細胞的分化。最近的調查結果顯示miR-206 和miR-29通過激活轉錄生長因子β-1(TGFβ-1)協(xié)同發(fā)揮作用〔42〕，共同調節(jié)miR-450b-5p的表達，抑制RMS中的肌源性終末分化〔43〕。2014年，Diao等〔44〕發(fā)現(xiàn)了miR-203在RMS中通過啟動子甲基化被沉默，導致細胞的增殖失調和分化異常?？傊?，miRNAs的不平衡表達參與肌源性分化的調控，其中大多數(shù)的miRNAs是低表達。

3 相關基因的研究對RMS診斷和治療的影響

融合基因陽性的ARMS比陰性的ARMS和ERMS預后差〔45〕。并且PAX3-FOXO1陽性的患者比PAX7-FOXO1陽性的患者預后差，伴隨著遠處轉移的患者4年總生存率只有8%，而PAX7-FOXO1陽性的ARMS患者4年總生存率為75%〔16〕。因此，對Pax3/7-FOXO1融合基因的研究有助于我們對其預后的判斷。

N-Myc在非胎兒小鼠和人體組織中很難表達，提示N-Myc作為一個癌癥特異性治療靶點的可能性。Tonelli等〔20〕用PNA-MYCN治療小鼠ARMS模型，用微PET評估療效發(fā)現(xiàn)：其中75%的樣本腫瘤消除，25%的樣本腫瘤信號很大程度的減少，其中腫瘤消除的樣本30 d后復查示病灶沒有復發(fā)。

RAS通路的突變對于ERMS的危險分級有重要意義，RAS途徑突變的患者約占高危分組的75%(6/8)、中危的45%(5/11)、低危的0%(0/10)；在ARMS樣本中沒有發(fā)現(xiàn) RAS的突變〔28〕。由于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路與RAS通路是相互作用的，因此BGT-226作為PI3K和RAS雙重通路抑制劑有明顯的療效?，F(xiàn)在已經有幾個臨床試驗在檢測PI3K和RAS通路抑制劑的組合，但是還沒有明確的結果。

目前以氧化應激為靶點的治療方式成為治療RMS的研究熱點，由于活性氧(ROS)持續(xù)升高時可促使細胞發(fā)生轉化，導致惡性腫瘤的發(fā)生。RMS腫瘤細胞由于代謝活性的增加、致癌因素的刺激和線粒體的功能障礙，可表達高水平的ROS。ERMS腫瘤中ROS增高是由于高頻率的 G/T點突變和p38 MAPK通路中一些基因的過表達〔46〕。92%的ERMS腫瘤會發(fā)生8號染色體的擴增〔39〕和MCU/MICU1表達下調，都會導致線粒體功能障礙和氧化應激〔47〕。因此，降低橫紋肌肉瘤細胞的氧化應激水平是治療RMS的一個有效措施。目前有幾種藥物對于治療小鼠ERMS異種移植腫瘤模型有顯著療效，比如卡非佐米、金諾芬、西立伐他汀和哇巴因，它們都是以氧化應激為靶點，誘導細胞的線粒體死亡，從而降低ROS的水平〔28〕。

YAP1主要通過抑制肌肉的終末分化發(fā)揮致癌作用，導致患者的臨床預后較差。由于YAP是通過YAP-TEAD復合物發(fā)揮致癌作用，因此YAP-TEAD可作為治療靶點。雖然現(xiàn)在新的轉基因動物模型和Hippo通路基因敲出模型已經成功構造，同時被應用于分析此通路在生物體的機制，但是還沒有充分的證據證明YAP1的抑制劑可以用于人體RMS的治療，因此還沒有相關的藥物進入臨床試驗。

4 結 語

隨著高通量測序和全基因組測序技術的發(fā)展，對影響RMS的分子生物學機制和潛在的靶向分子治療提供了線索，但是RMS的具體發(fā)病機制尚不完全清楚。雖然靶向藥物治療是目前橫紋肌肉瘤治療一個研究熱點，但是進入臨床試驗的抗腫瘤靶向藥物很少，所以仍需進行進一步探索與研究。

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〔2015-03-17修回〕

(編輯 郭 菁)

國家自然科學基金(81372870)

馬克威(1968-)，男，教授，碩士生導師，主要從事腫瘤細胞信號傳導通路的調控研究。

撒煥蘭(1989-)，女，在讀碩士，主要從事橫紋肌肉瘤細胞信號傳導通路的調控研究。

R739

A

1005-9202(2015)12-3482-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.141