干細(xì)胞移植治療腦缺血的研究進(jìn)展

高海軍劉朋飛金明月1牟青春2黃海燕

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)腫瘤外科，吉林長(zhǎng)春130021)

關(guān)鍵詞〔〕干細(xì)胞移植；腦缺血

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R743.31〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

通訊作者：黃海燕(1963-)，男，副教授，博士生導(dǎo)師，主要從事顱內(nèi)腫瘤的診斷治療和膠質(zhì)瘤的光動(dòng)力和內(nèi)放射治療及脊髓及先天性疾病顯微外科治療研究。

1吉林大學(xué)第一醫(yī)院兒科超聲室

2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院神經(jīng)外科

第一作者：高海軍(1987-)，男，碩士在讀，主要從事顱腦相關(guān)腫瘤研究。

缺血性腦卒中是老年人致死致殘的主要疾病，且發(fā)病有逐年上升趨勢(shì)〔1〕。干細(xì)胞具有自我更新并分化為多種細(xì)胞系的能力〔2〕。在體外實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPS)可以來(lái)自成人的正常細(xì)胞，并分化成為特定類(lèi)型的神經(jīng)細(xì)胞。有報(bào)道〔3，4〕指出腦缺血大鼠在干細(xì)胞移植治療后繼發(fā)了腫瘤形成。iPS誘導(dǎo)腫瘤形成的可能，限制了這一治療的臨床應(yīng)用。在體外實(shí)驗(yàn)中，胚胎干細(xì)胞(ESCs)具有分化為人體所有類(lèi)型細(xì)胞的能力，并且可以無(wú)限制的自我更新。人類(lèi)ESCs是多能分化的，并且可以從5d大的人類(lèi)囊胚中獲得。然而由于倫理問(wèn)題和導(dǎo)致腫瘤生成的風(fēng)險(xiǎn)〔5〕，ESCs移植的臨床試驗(yàn)評(píng)估并不樂(lè)觀。除了誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞和ESCs，成人干細(xì)胞是PS并可以從多種渠道獲得。成人干細(xì)胞移植的優(yōu)點(diǎn)是其適用于自體和同種異體移植。目前，成人干細(xì)胞治療缺血性腦卒中可以分為內(nèi)源性和外源性?xún)煞N。前者是應(yīng)用內(nèi)源性干細(xì)胞；后者與外源性的干細(xì)胞移植有關(guān)。然而，成人干細(xì)胞移植和iPSCs及ESCs相比在分化潛能上并沒(méi)有優(yōu)勢(shì)。

1內(nèi)源性干細(xì)胞移植

1.1神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一些區(qū)域存在內(nèi)源性NSCs，主要分布于青壯年海馬和室管膜下區(qū)(SVZ)，但這些內(nèi)源性NSCs處于休眠狀態(tài)。腦缺血促進(jìn)了海馬和室管膜下區(qū)細(xì)胞增殖和神經(jīng)母細(xì)胞的形成，從而促進(jìn)內(nèi)源性NSCs遷移至缺血區(qū)域并分化為神經(jīng)元整合到受損區(qū)域發(fā)揮作用〔6〕。腦缺血后在海馬和室管膜下區(qū)都觀察到了NSCs的增殖和分化增強(qiáng)。最近研究表明，刺激內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞生成可以促進(jìn)腦卒中后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)〔7〕，但由內(nèi)源性NSCs產(chǎn)生的神經(jīng)元數(shù)量極低，這與缺血環(huán)境不適合新生的神經(jīng)元生存有關(guān)。這些新生的神經(jīng)細(xì)胞大多數(shù)死亡或者分化為膠質(zhì)細(xì)胞。因此，刺激成人內(nèi)源性NSCs對(duì)于缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能恢復(fù)的作用是有限的。

1.2造血干細(xì)胞(HSCs)另一種內(nèi)源性干細(xì)胞療法是使用粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，一種作用于HSCs的生長(zhǎng)因子。G-CSF是一種調(diào)節(jié)原始中性粒細(xì)胞增殖和分化的糖蛋白。在大鼠腦缺血模型中，G-CSF通過(guò)促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞生成發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用和神經(jīng)再生的作用，從而減小缺血面積，改善行為，促進(jìn)感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)〔8〕。但G-CSF對(duì)HSCs的作用是否適用于人類(lèi)尚不清楚。事實(shí)上，受缺血環(huán)境的影響，內(nèi)源性HSCs存活增殖和分化的可能性很小。因此，通過(guò)內(nèi)源性干細(xì)胞難以完成缺血后腦組織損傷修復(fù)。

2外源性干細(xì)胞移植

2.1ESCs具有無(wú)限制的自我復(fù)制和多潛在的多種分化能力，來(lái)源于胚泡早期的囊胚內(nèi)細(xì)胞群，具有在特殊條件下分化成機(jī)體NSCs多種干細(xì)胞的潛能，使得ESCs成為進(jìn)行細(xì)胞移植最為理想的細(xì)胞來(lái)源〔9,10〕。機(jī)體內(nèi)ESCs首先由Evans等〔11〕從小鼠囊胚分離獲得,而體外ESCs則由Thomson等〔12〕從冷凍的體外受精多余囊胚中分離獲得。研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)育和成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均存在著NSCs〔13〕，目前通過(guò)采用ESCs移植的動(dòng)物的大量實(shí)驗(yàn)顯示ESCs源性的神經(jīng)元細(xì)胞移植入動(dòng)物后，可以和動(dòng)物的大腦吻合在一起〔14〕，這為臨床上腦缺血的細(xì)胞替代治療提供了一種理想的細(xì)胞。目前利用ESCs誘導(dǎo)分化NSCs較公認(rèn)的方法是：利用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子譜系選擇法。其中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是早期神經(jīng)前體細(xì)胞生存、增殖的重要因子，這一方法由Okabe等〔15〕所建立，通過(guò)該誘導(dǎo)方法得到的神經(jīng)元細(xì)胞，傾向于中腦、后腦部位的神經(jīng)元。雖然取得了很大的突破，但是ESCs在臨床上應(yīng)用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病還是存在很大問(wèn)題，如安全性、細(xì)胞系在體外的保存、移植后排斥反應(yīng)、致畸性及倫理、法律問(wèn)題〔5〕，上述情況均限制了ESCs移植在腦缺血治療方面的發(fā)展。

2.2NSCs外源性的NSCs多來(lái)源于胚胎或胎兒。關(guān)于動(dòng)物模型的研究表明移植后的NSCs可以生存、增殖、分化為神經(jīng)細(xì)胞，并移行至缺血區(qū)域發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔16〕。而且外源性NSCs在促進(jìn)缺血性腦卒中患者功能恢復(fù)的同時(shí)不會(huì)引起腫瘤形成〔17〕。人NSCs可從嬰兒紋狀體和大腦皮質(zhì)中分離而來(lái)。將人NSCs植入腦缺血的大鼠腦內(nèi)，NSCs可移行至缺血區(qū)域，增殖分化為神經(jīng)元，并改善感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能〔17〕。有人研究發(fā)現(xiàn)將NSCs移植入腦缺血大鼠腦內(nèi)，能明顯修復(fù)缺血性腦損傷。然而，存活并分化為神經(jīng)元的NSCs很少，這些細(xì)胞要么死亡要么停止分化〔18〕。NSCs的另一個(gè)缺點(diǎn)是從患者體內(nèi)分離出的NSCs在臨床應(yīng)用方面不具可行性。由于人NSCs的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用及其較小的致腫瘤生成的風(fēng)險(xiǎn)，在過(guò)去的10年中它被廣泛應(yīng)用于臨床前期腦缺血的研究。最近一個(gè)由英國(guó)公司發(fā)起的臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示，所有進(jìn)行移植的患者均未發(fā)生移植相關(guān)不良反應(yīng)。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)患者的感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能在移植人NSCs6～12w后有所改善〔19〕，這表明對(duì)缺血性腦卒中患者進(jìn)行NSCs移植是安全可行的。

2.3間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)MSCs具有分化為神經(jīng)細(xì)胞包括神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力。關(guān)于動(dòng)物腦缺血模型的研究表明MSCs移植能顯著促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。這種功能恢復(fù)主要是由于這些細(xì)胞可以分泌大量的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，參與血管生成，愈合及組織修復(fù)過(guò)程〔20〕。人類(lèi)MSCs可來(lái)源于成人骨髓、外周血、臍帶血及脂肪組織，它們可以分化為多種組織如骨、軟骨及脂肪組織等。骨髓MSCs能在腦缺血大鼠體內(nèi)通過(guò)下調(diào)細(xì)胞凋亡蛋白酶3基因的表達(dá)，從而抑制腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Honmou等〔21〕用自體人MSCs移植第一次評(píng)估了干細(xì)胞治療缺血性腦卒中的可行性與安全性。對(duì)這些患者5年的隨訪(fǎng)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，但功能恢復(fù)也不是很明顯。人MSCs可以對(duì)灰質(zhì)或白質(zhì)或兩者都產(chǎn)生顯著作用〔22〕，MRI檢查顯示腦梗死面積在移植后1w減少了20%。臨床研究表明hMSCs能促進(jìn)腦缺血患者功能恢復(fù)，而且沒(méi)有副反應(yīng)。由于rMSCs能從自體器官獲得，因而移植后無(wú)需進(jìn)行免疫抑制治療，這是其主要優(yōu)點(diǎn)。人MSCs不會(huì)引起倫理方面的爭(zhēng)議。MSCs易獲得和增殖，并能定向遷移至受損腦組織，分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)〔23〕。

2.4HSCs(CD34+) 另一種可用于移植的PS為HSCs。同樣，有大量將HSCs移植用于腦缺血患者治療的研究。臨床前研究已經(jīng)表明HSCs移植對(duì)腦缺血大鼠具有明顯的作用。其中一些研究已經(jīng)證實(shí)在大鼠腦缺血后48 h移植HSCs(CD34+)，大鼠腦缺血半暗帶區(qū)血管生成增加，隨后神經(jīng)再生增加。這種血管再生能調(diào)節(jié)腦缺血后神經(jīng)重塑和神經(jīng)再生〔24〕。研究表明，在腦缺血后1w的大鼠顱內(nèi)直接移植HSCs(CD34+)能提高大鼠神經(jīng)和血管再生。這些移植的細(xì)胞還能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。人臍帶血可以是HSCs的來(lái)源，但實(shí)際能獲得的HSCs很少。骨髓為自體HSCs移植提供了最佳選擇，盡管獲取過(guò)程比較痛苦〔25〕。目前，HSCs移植已用于臨床實(shí)驗(yàn)如腦缺血的治療，腦缺血的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵呀?jīng)表明其具有提高神經(jīng)保護(hù)和再生的作用〔26〕。人HSCs在維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷方面具有重要作用。HSCs的優(yōu)點(diǎn)在于它適用于自體細(xì)胞移植也適用于同種異體移植，而且也不會(huì)引起倫理方面的問(wèn)題。缺點(diǎn)是其與從骨髓中獲得的細(xì)胞數(shù)量和分化的一致性有關(guān)，尤其對(duì)于老年患者。不同來(lái)源的HSCs(CD34+)移植的安全性與可行性仍處于臨床試驗(yàn)當(dāng)中。

2.5骨髓單核細(xì)胞(BMMNCs)BMMNCs包括間充質(zhì)和HSCs。它們易于從骨髓獲得并且適用于自體及同種異體移植。在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭蠦MMNCs被發(fā)現(xiàn)可以改善神經(jīng)功能缺陷并減小腦缺血面積〔27〕。BMMNCs的優(yōu)點(diǎn)是其易于從骨髓獲得，這使其更適用于臨床應(yīng)用。很多臨床實(shí)驗(yàn)表明BMMBCs已經(jīng)應(yīng)用于慢性腦缺血的病人〔28〕。經(jīng)過(guò)6個(gè)月的隨訪(fǎng)，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與治療有關(guān)的不良反應(yīng)。所有的患者在移植后2h都可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移。

3腦缺血的干細(xì)胞療法(SCT)

3.1SCT的時(shí)間選擇干細(xì)胞移植治療缺血性腦卒中的最佳移植時(shí)間取決于治療目的。如果治療目標(biāo)是獲得神經(jīng)保護(hù)作用，則急性期移植是可取的。如果治療目標(biāo)是為了促進(jìn)內(nèi)源修復(fù)和抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，則急性或亞急性治療是必要的。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，在腦缺血后24h和72h進(jìn)行BMMNCs移植，神經(jīng)功能得到顯著改善;而腦缺血后7d后進(jìn)行注射則沒(méi)有明顯效果〔29〕。目前，最佳治療時(shí)間尚需進(jìn)一步研究。

3.2SCT的劑量大劑量的干細(xì)胞可能會(huì)增加潛在風(fēng)險(xiǎn)，如增加腫瘤形成和動(dòng)脈內(nèi)注射形成血栓的風(fēng)險(xiǎn)等。因此，臨床前研究仍須對(duì)移植細(xì)胞數(shù)量相關(guān)毒性進(jìn)行評(píng)估。

3.3SCT的移植途徑在臨床研究和臨床前實(shí)驗(yàn)研究中有幾個(gè)移植途徑。立體定向顱內(nèi)移植能將干細(xì)胞直接注入受損區(qū)域，這一路徑效果更好。但此路徑為有創(chuàng)性操作，并且可能破壞鄰近腦組織。另一方面，動(dòng)脈內(nèi)注射可能導(dǎo)致很高的死亡率〔30〕。靜脈內(nèi)注射最簡(jiǎn)單最安全，為非侵入性過(guò)程，但可能使干細(xì)胞向非耙器官聚集，如肺、肝及脾等，使得腦內(nèi)缺血區(qū)干細(xì)胞不足〔31〕。移植途徑必須考慮有效性與安全性的問(wèn)題。目前，移植的最佳路徑尚未確定。

3.4細(xì)胞追蹤非侵入性的影像學(xué)手段對(duì)于評(píng)估缺血區(qū)域非常重要。追蹤干細(xì)胞并監(jiān)測(cè)干細(xì)胞的存活、遷移及對(duì)大腦功能的影響。在目前的臨床前期研究中，其中一種追蹤方法是應(yīng)用超順磁氧化鐵顆粒(SPIO)標(biāo)記細(xì)胞的方法。此外，磁共振成像(MRI)、生物發(fā)光成像(BLI)、PET、SPECT也能用于對(duì)體內(nèi)移植的干細(xì)胞進(jìn)行追蹤。最近一項(xiàng)研究證實(shí)PET能用于測(cè)量?jī)?nèi)源性NSCs在體內(nèi)的活化情況，尤其是腦缺血后SVZ區(qū)的情況。然而，如果干細(xì)胞與標(biāo)志物發(fā)生分離，追蹤則會(huì)失敗或是導(dǎo)致追蹤信號(hào)極度減弱。另外，如果干細(xì)胞死亡或被巨噬細(xì)胞吞噬，獲得的信號(hào)就會(huì)具有誤導(dǎo)性。一些納米粒子如PVBM涂層γ-Fe2O3的納米顆粒和熒光量子點(diǎn)已經(jīng)被證實(shí)沒(méi)有細(xì)胞毒性，并且干細(xì)胞標(biāo)記在動(dòng)物模型中很有效。納米粒子為干細(xì)胞移植研究帶來(lái)了光明的前景，尤其對(duì)于體內(nèi)細(xì)胞追蹤，這對(duì)干細(xì)胞治療研究的幾個(gè)障礙產(chǎn)生了重要影響。

4小結(jié)

對(duì)大鼠腦缺血模型的研究使腦缺血病人的干細(xì)胞移植治療充滿(mǎn)前景。這一治療通過(guò)調(diào)節(jié)多種機(jī)制發(fā)揮作用，可能涉及新的神經(jīng)通路形成，抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管和神經(jīng)再生，這與內(nèi)源性修復(fù)一致。目前，大量臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了不同途徑干細(xì)胞療法的有效性、安全性和可行性。然而何種來(lái)源的干細(xì)胞(hNSCs、hMSCs、HSCs等)最適用于治療缺血性腦卒中尚不清楚。此外，在動(dòng)物模型中干細(xì)胞移植后的生物學(xué)行為改變不能完全反映這些細(xì)胞在患者體內(nèi)是如何活動(dòng)的。而且動(dòng)物模型不能完全模擬腦缺血患者各方面的病理情況。總之，干細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用還面對(duì)諸多挑戰(zhàn)，仍需進(jìn)一步研究。但無(wú)疑，干細(xì)胞移植將為未來(lái)治療腦缺血提供新的方法。

5參考文獻(xiàn)

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〔2015-04-25修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)