RNA干擾K-ras基因?qū)Ψ蜗侔〩441細(xì)胞EGFR-TKI耐藥性的影響

胡述提金冰林濤

(南陽市中心醫(yī)院胸外科，河南南陽473000)

摘要〔〕目的探討RNA干擾K-ras基因?qū)Ψ蜗侔〩441細(xì)胞株細(xì)胞EGFR-TKI耐藥性的影響。方法構(gòu)建靶向K-ras基因的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染肺腺癌H441細(xì)胞，分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中K-ras蛋白及基因表達(dá)以及對(duì)吉非替尼敏感性的改變。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組中K-ras基因及蛋白的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)。結(jié)論靶向突變K-ras基因的siRNA可以誘導(dǎo)肺腺癌H441細(xì)胞凋亡，減弱對(duì)吉非替尼的耐藥性，為肺癌的基因治療提供了新的思路和方法。

關(guān)鍵詞〔〕RNA干擾;肺腺癌;吉非替尼;耐藥

中圖分類號(hào)〔〕R734.2〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：胡述提(1978-)，男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事胸部疾病的臨床工作。

應(yīng)用表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，已使眾多肺癌患者獲益。多項(xiàng)臨床研究顯示，EGFR-TKI治療肺癌的療效與肺癌EGFR基因突變有關(guān)，而與EGFR蛋白免疫組織化學(xué)表達(dá)水平高低無明顯關(guān)系；對(duì)突變型基因肺癌，EGFR-TKI治療的有效率可以高達(dá)50%以上，而對(duì)野生型基因肺癌的有效率則低于10%〔1〕。K-ras基因是EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)，該基因的突變可以引起EGFR信號(hào)通路的EGFR非依賴性持續(xù)性激活，進(jìn)而導(dǎo)致EGFR-TKI原發(fā)性耐藥〔2〕。本研究探討RNA干擾K-ras基因?qū)Ψ蜗侔〩441細(xì)胞株細(xì)胞EGFR-TKI耐藥性的影響。

1材料與方法

1.1材料人肺腺癌H441細(xì)胞株(突變型K-ras)購自ATCC公司，在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，用胰酶細(xì)胞消化液〔含0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)；質(zhì)粒pSilencer3.1購自Ambion公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司；兔抗人K-ras、β-actin一抗及羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。四甲基偶氮唑鹽(MTT)購于Sigma公司。RPMI 1640培養(yǎng)液及胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司。吉非替尼(商品名：易瑞沙)由Astra Zeneca公司惠贈(zèng)。

1.2pSilencer3.1表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計(jì)63 bp具有互補(bǔ)序列且能夠編碼shRNA的雙鏈寡核苷酸，正義：5’-GATCCGTTGGAGCTGTTGGCGTAGTTCAAGAGACTACGCCAACAGCTCCAAC TTTTTT11GGAAA-3’，反義:5’-AGCTTTTCCAAAAAAGTTGGAGCTGTTGGCGT-AGTCTCTTGAACTACGCCAACAGCTCCAAC G-3’，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所形成的siRNA作用靶點(diǎn)為K-ras mRNA 206～225位的核苷酸，第12位密碼子由GGT突變?yōu)镚TT。陰性對(duì)照雙鏈寡核苷酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物所形成的siRNA的作用序列為：5’-GGTTCATAAGGCGCTAGC-3’。將上述合成的雙鏈寡核苷酸退火后與pSilencer3.1線性載體定向連接并行核酸測(cè)序，命名為pSilencer3.1-K-ras。

1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分組實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、空載體組及實(shí)驗(yàn)組。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H441細(xì)胞按1.5×105個(gè)/孔接種于24孔板，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)。次日待細(xì)胞70%～80%融合時(shí)，每孔均按總量3 μg的質(zhì)粒載體分別用LipofectaminelTM進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后用含G418的培養(yǎng)液篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并傳代。

1.4RT-PCR方法檢測(cè)K-ras mRNA 收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA。RT-PCR體系中加入兩對(duì)引物，第一對(duì)為內(nèi)參β-actin基因的引物，正義引物：5’-CTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGG-3’，反義引物：5’-GCTRACATGTCTCGATCCCACTRAA-3’，PCR擴(kuò)增片段為394 bp；第二對(duì)是K-ras基因的引物，正義引物：5’-GACTGAATATAAACTTGTGG-3’，反義引物：5’- CTATTGTTGGATCATATTCG-3’，PCR擴(kuò)增片段為107 bp。RT-PCR擴(kuò)增條件：50℃ 30 min，94℃ 2 min；變性94℃ 30 s；復(fù)性58℃ 30 s及延伸72℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。圖像分析系統(tǒng)測(cè)定灰度比值，目的片段相對(duì)表達(dá)量=K-ras灰度值/內(nèi)參β-actin灰度值。

1.5Western印跡檢測(cè)K-ras蛋白的表達(dá)使用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺弱膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)膜、室溫封閉2 h，一抗4℃反應(yīng)過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，增強(qiáng)發(fā)光底物(ECL)試劑反應(yīng)發(fā)光，X線片顯影。圖像分析系統(tǒng)測(cè)定灰度比值。

1.6四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后，以1×104個(gè)/ml接種于96孔培養(yǎng)板，100 μl/孔，自轉(zhuǎn)染當(dāng)天開始，每組每天取3孔細(xì)胞，MTT法檢測(cè)各孔光密度(A)值，以570 nm處吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7細(xì)胞凋亡檢測(cè)胰酶消化各組細(xì)胞，調(diào)整密度為3×105個(gè)/ml，冰磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，分別加入annexin V-APC 5 μl和PI溶液10 μl，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton-Dickinson公司)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，使用Cell Quest軟件進(jìn)行分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件行單因素方差分析，

2結(jié)果

2.1pSilencer3.1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定將重組質(zhì)粒載體pSilencer3.1-K-ras進(jìn)行序列分析，測(cè)序結(jié)果正確，表明重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2轉(zhuǎn)染后H441細(xì)胞株K-ras mRNA的表達(dá)情況pSilencer3.1-K-ras轉(zhuǎn)染組細(xì)胞K-ras mRNA表達(dá)量(40.8%±4.2%)較對(duì)照組(92.3%±3.1%)明顯減弱(P<0.05)。空載體組灰度比值為90.6%±1.9%。

2.3轉(zhuǎn)染后H441細(xì)胞株細(xì)胞K-ras蛋白的表達(dá)情況pSilencer3.1-K-ras轉(zhuǎn)染組細(xì)胞K-ras蛋白質(zhì)表達(dá)明顯抑制?？蛰d體組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的灰度比值分別為：97.2%±3.1%、96.3%±1.8%、35.1%±2.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4siRNA對(duì)細(xì)胞增殖的影響MMT法所測(cè)生長(zhǎng)曲線顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速度減慢，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制(P<0.05)。

2.5siRNA對(duì)細(xì)胞凋亡的影響實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯升高，為26.3%±3.2%，而空載體組、陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為6.9%±1.8%、8.6%±3.0%，三組相比差異顯著(P<0.05)。

3討論

EGFR-TKI是近年來肺癌治療領(lǐng)域的重大突破，研究結(jié)果顯示，部分NSCLC的EGFR基因存在特定的外顯子18-21突變，導(dǎo)致EGFR信號(hào)通路持續(xù)性激活，造成攜帶這些突變的腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI高度敏感〔1〕。Ras基因定位于染色體11q13，包括H-ras、K-ras和N-ras，其編碼的蛋白位于細(xì)胞膜上的鳥苷酸結(jié)合蛋白，負(fù)責(zé)將細(xì)胞外部信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到內(nèi)部。Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路是EGFR通路的一部分，K-ras基因在多達(dá)30%的NSCLC中可出現(xiàn)激活性突變，且以腺癌為主，突變的K-Ras 基因不依賴上游EGFR的活化，不斷激活MAPK信號(hào)途徑的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及抵抗凋亡〔2〕。激活EGFR通路的EGFR突變使得藥物更加敏感，而激活EGFR下游ras通路的K-ras突變多引起耐藥，甚至同時(shí)攜帶EGFR突變和K-ras突變的肺癌，也可引起原發(fā)性耐藥〔3〕。對(duì)于EGFR下游通路研究顯示，突變的K-ras替代EGFR激活下游通路，從而導(dǎo)致EGFR抑制劑耐藥的發(fā)生。也有研究表明抑制突變K-ras的表達(dá)，可有效抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)〔2〕。

siRNA是與靶基因同源的雙鏈RNA誘導(dǎo)的特異轉(zhuǎn)錄后基因沉默的一種現(xiàn)象。RNA干擾技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是快速、有效且序列特異性強(qiáng)，在某種程度上可替代傳統(tǒng)的反義核酸技術(shù)及基因敲除技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)RNAi抑制目的基因的作用強(qiáng)于反義寡核苷酸〔4〕。近年來RNAi技術(shù)已逐漸應(yīng)用于腫瘤的基因治療研究，并取得一定效果，Brummelkamp等〔5〕應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒將SiRNA導(dǎo)入人胰腺癌、卵巢癌細(xì)胞，特異且穩(wěn)定地抑制癌基因K-ras的表達(dá)，使腫瘤生長(zhǎng)能力降低，逆轉(zhuǎn)了腫瘤細(xì)胞的惡性表型。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性阻斷突變K-ras基因的表達(dá)，可為肺癌的基因治療提供了新的思路和方法。

本研究結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)吉非替尼的IC50明顯下降，提示干擾k-ras能一定程度地恢復(fù)H441細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。細(xì)胞的凋亡率和吉非替尼細(xì)胞增殖抑制率均明顯升高，對(duì)吉非替尼的敏感性增強(qiáng)，這表明K-ras-siRNA能夠下調(diào)H441細(xì)胞內(nèi)K-ras基因的表達(dá)，有效抑制ras通路的活化，進(jìn)而引發(fā)一系列的細(xì)胞或分子生物學(xué)的改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，通過下調(diào)K-ras的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)K-ras突變細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥，因此，以突變K-ras基因?yàn)榘悬c(diǎn)，利用RNA干擾技術(shù)治療肺癌可望成為有效地基因治療方法。

4參考文獻(xiàn)

1Uramoto H,Mitsudomi T.Which biomarker predicts benefit from EGFR-TKI treatment for patients with lung cancer〔J〕?Br J Cancer,2007;96(6):857-63.

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3Jackson EL,Willis N,Mercer K,etal.Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras〔J〕.Genes N Dev,2001;15(24):3243-8.

4Zamore PD,Tuschl T,Sharp PA,etal.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals〔J〕.Cell,2000;101(1):25-33.

5Brummelkamp TR,Bernards R,Agami R.Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference〔J〕.Cancer cell,2002；2(3):243-7.

〔2014-11-07修回〕

(編輯袁左鳴)