李健春，王瓊

(瀘州醫(yī)學院，四川 瀘州 646000)

核酸疫苗(nucleic acid vaccine)是一種新型的基因工程疫苗，它將含有編碼一種或幾種抗原蛋白基因序列的重組質(zhì)粒導入機體的細胞內(nèi)，然后在宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達抗原蛋白，誘導機體生成相應的細胞免疫應答與體液免疫，接種的機體因此得到了其提供的免疫保護，能夠有效防病治病。由于其良好的免疫原性、安全性、制備工藝簡單等特點，核酸疫苗越來越受到人們的重視。卵黃內(nèi)含有一種免疫球蛋白，稱之為卵黃免疫球蛋白(yolk immunoglobulin，IgY)，是家禽血液內(nèi)的IgG經(jīng)受體介導轉(zhuǎn)移進入卵黃內(nèi)形成，能夠為新生個體提供防護。相對于哺乳動物的IgG，IgY的結(jié)構(gòu)特殊，且生物性能穩(wěn)定，對一些疾病防護作用更好，因此被認為是一種新生代抗體。用核酸疫苗制備特異性IgY，是將核酸疫苗技術(shù)和IgY技術(shù)優(yōu)點結(jié)合起來。本文就核酸疫苗制備IgY的特點及其應用現(xiàn)狀進行了綜述。

1 核酸疫苗

核酸疫苗包括DNA疫苗、RNA疫苗和病毒載體疫苗三類［1］，是指將外源目的基因片段構(gòu)建在質(zhì)粒載體中，將其直接導入宿主體內(nèi)，通過宿主細胞表達目的蛋白，進而對機體產(chǎn)生刺激，機體受到刺激后形成特異性免疫學反應，能夠用于疾病的防治。核酸疫苗在疾病防治中特點主要體現(xiàn)在4個方面:①與重組蛋白相比，抗原蛋白以天然結(jié)構(gòu)呈遞給宿主免疫識別系統(tǒng)，誘導機體產(chǎn)生特異性抗體，解決了體外制備抗原蛋白的改變或丟失問題［2］。②核酸疫苗可以在寄宿機體內(nèi)部持續(xù)表達抗原蛋白，從而對機體產(chǎn)生刺激，形成持久性的免疫反應，免疫劑量也得以減少，降低了生產(chǎn)成本。③可同時誘導體液免疫和細胞免疫反應，使宿主產(chǎn)生比使用大部分傳統(tǒng)疫苗更有效的免疫應答。④核酸疫苗研發(fā)周期短，生產(chǎn)成本低，且便于貯藏，在實際生產(chǎn)中具有優(yōu)勢［3］。

雖然核酸疫苗的優(yōu)點眾多，但不可否認其也存在著一些缺陷。表現(xiàn)為:①質(zhì)粒導入細胞效率不高，產(chǎn)生的免疫水平偏低。已經(jīng)有很多研究試圖通過新的技術(shù)和方法如電穿孔法［4－5］，選擇合適的佐劑［6］等以提高免疫效果。②核酸疫苗的應用仍然存在著安全風險，尚未得到一致認可。雖然應用至今，還沒有出現(xiàn)核酸疫苗導致基因整合的案例，但是質(zhì)粒DNA低水平整合到宿主基因組內(nèi)有發(fā)生的可能性，進而導致發(fā)生諸如細胞癌變、基因紊亂、細胞轉(zhuǎn)型的嚴重后果。所以，目的基因表達的可控性、核酸疫苗的安全性等問題亟需得到妥善處理。

2 IgY的分子特性

IgY是通過特異性受體介導并轉(zhuǎn)移富集于卵黃中的多克隆抗體。IgY包含2條輕鏈(2L)和2條重鏈(2H)，輕鏈和重鏈通過二硫鍵相連接，輕鏈由一個可變區(qū)和一個恒定區(qū)組成，而重鏈是由一個可變區(qū)和四個恒定區(qū)組成［7］。IgY相對分子質(zhì)量為180×103，等電點在pH 5.7～7.6之間。和哺乳動物IgG相比，IgY缺少鉸鏈結(jié)構(gòu)，因此比后者更加穩(wěn)定。

IgY性能穩(wěn)定，IgY在60～65℃加熱活性不會明顯下降，但在70℃ 加熱僅15 min活性就會迅速降低。有研究表明，在緩沖體系中添加糖類可以提高IgY熱穩(wěn)定性［8］。IgY在 pH 4.0 ～11.0時穩(wěn)定，在pH 3.5時活性迅速下降，pH 3.0時幾乎完全失去活性。類似地，在緩沖體系中添加糖類、多元醇等穩(wěn)定劑可以顯著提高IgY pH耐受性［9］。此外，IgY對胃蛋白酶具有較高的抵抗力，并且可黏附于細菌鞭毛上，使細菌不能黏附于腸道黏膜上皮細胞［10］，提示IgY可以用于胃腸細菌感染的預防和治療。幽門螺桿菌與慢性胃炎、消化性潰瘍和胃黏膜相關(guān)組織淋巴瘤(MALT)的發(fā)生密切相關(guān)，夏麗君等［11］用 HpaA－VacA IgY 通過灌胃方式對BALB/c小鼠胃黏膜幽門螺桿菌感染模型預防作用的研究，發(fā)現(xiàn)口服HpaA－VacA IgY能有效預防幽門螺桿菌感染引起的胃黏膜炎癥反應。Mulevy等［12］通過倉鼠艱難梭菌感染模型研究發(fā)現(xiàn)高濃度特異性IgY治療能夠降低艱難梭菌引起的急慢性結(jié)腸炎的發(fā)生率。由于抗生素的濫用，治療金黃色葡萄球菌引起的感染面臨巨大的挑戰(zhàn)，彭維等［13］通過體外抑菌實驗發(fā)現(xiàn)抗金黃色葡萄球菌IgY能抑制其生長活性，抑菌率達到93.5%。表明IgY有望代替抗生素用于細菌感染性疾病的治療，避免菌群失調(diào)和耐藥性的產(chǎn)生。

3 核酸疫苗制備IgY

核酸疫苗制備抗體作為一種新的免疫手段具有巨大的商業(yè)價值，它可以針對編碼不同抗原蛋白產(chǎn)生特異性抗體。然而，在實際生產(chǎn)中，用核酸疫苗免疫的小鼠抗體產(chǎn)量很低，這成為了用核酸疫苗制備抗體的主要局限［14］。此外，鼠源性抗體在臨床治療中可誘發(fā)人抗鼠抗體(human anti－mouse antibody，HAMA)而導致不良反應，而且其不能有效地激活人體的生物效應，半衰期短，因而并不適用于人類的免疫治療［15］。

核酸疫苗制備IgY妥善處理了上面所述的各種問題，表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，表現(xiàn)在:①免疫反應的誘導不需要通過對蛋白抗原的提純來實現(xiàn)。蛋白抗原能夠在細胞內(nèi)部的原位表達實現(xiàn)，從而誘導免疫反應，于宿主體內(nèi)形成抗體［16］。與傳統(tǒng)抗體生產(chǎn)過程相比，這種方法可以妥善處理好耗時費力的抗原蛋白提純的前期準備，此外還能夠有效防止因為蛋白提純不完全導致產(chǎn)生潛在污染的問題。②生成的抗體質(zhì)量水平。由于鳥類與哺乳動物種系發(fā)生學的距離遠，鳥類對來自哺乳動物的抗原能夠產(chǎn)生強烈的免疫應答反應，因此形成的抗體的親和力與反應活性都非常好［17］。這種方法產(chǎn)生的抗體蛋白，經(jīng)過合成與翻譯后修飾過程可得到與其天然存在形式十分相近的構(gòu)象［18］。而且IgY不能激活哺乳動物的補體系統(tǒng)，不與哺乳動物的Fc受體、類風濕因子、葡萄球菌蛋白A、葡萄球菌蛋白G結(jié)合［19］，集高特異性和高靈敏性于一體，在免疫診斷中具有明顯的優(yōu)勢。③抗體的生產(chǎn)工藝簡單，生產(chǎn)效率高。卵黃中的主要成分是水、蛋白質(zhì)和脂類，IgY的分離純化多采用水稀釋法聯(lián)合鹽沉淀法［7］。IgY能夠大量聚集在卵黃內(nèi)部，只需要一個卵黃就可以制得60～100 mg IgY，因此每只雞或者鴨都可以看做一個生產(chǎn)抗體的小工廠［20］。④非侵入性手段制備。IgY是通過提取免疫動物所產(chǎn)蛋的卵黃而獲得，無需采血、無損傷，避免了采血給動物帶來的痛苦。歐洲替代方法驗證中心(ECVAM)建議以IgY代替哺乳動物IgG作為實驗和生產(chǎn)抗體的來源［21］。⑤通過該技術(shù)建立了一座連接基因序列與其所編碼蛋白質(zhì)的功能和生物學特性之間的橋梁，人們可以通過此技術(shù)獲得后基因組時代所需的各種抗體。

4 應用現(xiàn)狀

IgY抗體應用范圍十分廣泛，能夠?qū)⑵溥\用至被動免疫治療之中，研究型的診斷策略，劃分新發(fā)現(xiàn)的基因所編碼的新型蛋白質(zhì)的類型。

研究表明，用可表達產(chǎn)生幽門螺桿菌尿素酶B亞基(UreB)的質(zhì)粒免疫產(chǎn)蛋階段的鴨，在此之后能夠發(fā)現(xiàn)，鴨蛋的卵黃內(nèi)產(chǎn)生了抗 UreB的 IgY抗體［22］。將其抗體運用到慢性幽門螺桿菌感染的治療中能夠獲得很好的治療效果。

在水產(chǎn)動物疾病治療方面，Lu等［23］用編碼對蝦白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)囊膜蛋白Vp19和Vp28及核衣殼蛋白Vp15的融合基因DNA疫苗免疫蛋雞制得高抗WSSV活性IgY抗體，隨即用DNA疫苗為抗原制備的IgY和病毒體外中和液注射對蝦及鰲蝦后觀察死亡率，表明對WSSV具有很好的中和作用，延緩感染W(wǎng)SSV蝦體的死亡，降低其死亡率。同時發(fā)現(xiàn)用含CpG佐劑的DNA疫苗免疫組其抗體活性長時間持續(xù)在中等水平，免疫后110d，未見明顯降低。受此研究啟發(fā)，Witkowski等［24］用痘病毒 p28或 f1l基因保守序列構(gòu)建的DNA疫苗用基因槍注射法免疫蛋雞獲得了高滴度的特異性IgY抗體，免疫后120 d同樣未見明顯降低，提示抗原蛋白在體內(nèi)持續(xù)表達。

Abouzid等［25］同樣用這種方法制得了乙肝表面抗原(HBsAg)變異株特異性IgY抗體。由于HBsAg易變異，導致現(xiàn)有的臨床檢測試劑盒并不能檢出，而用HBsAg變異株特異性IgY抗體能夠用于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)變異株的免疫診斷，說明核酸疫苗制備IgY抗體在臨床診斷領(lǐng)域具有廣闊的市場空間。

5 小結(jié)與展望

近些年來，隨著基因組學和蛋白質(zhì)組學的迅猛發(fā)展，抗體在科學研究和臨床應用中占據(jù)了十分重要的地位，對抗體量的需求日益增加，低成本大規(guī)模的抗體制備正逐漸成為新的研究熱點。傳統(tǒng)的抗體制備方法是用大劑量高純度的抗原蛋白免疫動物，然而抗原蛋白的制備存在多種缺陷:在細菌中的弱表達、多以包涵體形式存在和純化回收率低等。此外，還存在與雜蛋白共免疫時產(chǎn)生的特異性較差等問題。核酸疫苗制備IgY克服了上述問題，具有成本低廉，適合大規(guī)模生產(chǎn)，獨特的抗體優(yōu)勢等特點，有望成為大規(guī)模制備抗體的有效手段，推進抗體的研究與發(fā)展。

［1］Ulmer JB，Mason PW，Geall A，et al.RNA－based vaccines［J］.Vaccine，2012，30(30):4414 －4418.

［2］吳庭才張春杰.核酸疫苗的特點、組成及在動物免疫中的應用［J］.生物學通報，2009，44(5):5－7.

［3］Lara AR，Ramirez OT，Wunderlich M.Plasmid DNA production for therapeutic applications［J］.Methods Mol Biol，2012，824:271－303.

［4］Chiarella P，F(xiàn)azio VM，Signori E.Electroporation in DNA vaccination protocols against cancer［J］.Curr Drug Metab，2013，14(3):291－299.

［5］Sardesai NY，Weiner DB.Electroporation delivery of DNA vaccines:prospects for success［J］.Curr Opin Immunol，2011，23(3):421－429.

［6］Lori F，Weiner DB，Calarota SA，et al.Cytokine－adjuvanted HIV－DNA vaccination strategies［J］.Springer Semin Immunopathol，2006，28(3):231 －238.

［7］Dias da Silva W，Tambourgi DV.IgY:a promising antibody for use in immunodiagnostic and in immunotherapy［J］.Vet Immunol Immunopathol，2010，135(3－4):173－180.

［8］Cook ME，Trott DL.IgY:Immune component of eggs as a source of passive immunity for animals and humans［J］.World Poult Sci，2010，89(2):215 －226.

［9］Kovacs－Nolan J，Mine Y.Egg yolk antibodies for passive immunity［J］.Annu Rev Food Sci Technol，2012，3:163 －182.

［10］馬玉英，蒙旭輝.雞卵黃抗體［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2013，32(4):24－25.

［11］夏麗君，楊致邦，黃偉.HpaA－VacA IgY對小鼠胃內(nèi)感染幽門螺桿菌的預防作用［J］.中國生物制品學雜志，2011，24(1):34－36.

［12］Mulvey GL，Dingle TC，F(xiàn)ang L，et al.Therapeutic potential of egg yolk antibodies for treating Clostridium difficile infection［J］.J Med Microbiol，2011，60(8):1181 －1187.

［13］彭維，歐愛芬.抗金黃色葡萄球菌IgY酶解穩(wěn)定性及體外抑菌研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，34(7):109－112.

［14］Weiner LM.Fully human therapeutic monoclonal antibodies［J］.J Immunother，2006，29(1):1 － 9.

［15］郭夕源，楊江華.人源性治療性抗體的應用與制備進展［J］.海南醫(yī)學，2013，24(1):107－110.

［16］Ferraro B，Morrow MP，Hutnick NA，et al.Clinical applications of DNA vaccines:current progress［J］.Clin Infect Dis，2011，53(3):296－302.

［17］Tini M，Jewell UR，Camenisch G，et al.Generation and application of chicken egg－yolk antibodies［J］.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2002，131(3):569 －574.

［18］Michel ML.Towards immunotherapy for chronic hepatitis B virus infections［J］.Vaccine，2002，20(4):83 －88.

［19］史同瑞，黃宇翔，蘇永福.卵黃免疫球蛋白的性質(zhì)與特點［J］.動物醫(yī)學進展，2010，31(2):114－117.

［20］Rollier C，Charollois C，Jamard C，et al.Maternally transferred antibodies from DNA－immunized avians protect offspring against hepadnavirus infection［J］.J Virol，2000，74(10):4908 －4911.

［21］易全茂，謝艷霞.雞卵黃抗體研究進展［J］.動物科學與動物醫(yī)學，2004，21(2):44－45.

［22］Kazimierczuk K，Cova L，Ndeboko B，et al.Genetic immunization of ducks for production of antibodies specific to Helicobacter pylori UreB in egg yolks［J］.Acta Biochim Pol，2005，52(1):261－266.

［23］Lu Y，Liu J，Jin L，et al.Passive protection of shrimp against white spot syndrome virus(WSSV)using specific antibody from egg yolk of chickens immunized with inactivated virus or a WSSV－DNA vaccine ［J］.Fish Shellfish Immunol，2008，25(5):604－610.

［24］Witkowski PT，Bourquain DR，Hohn O，et al.Gene gun－supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus－specific IgY antibodies［J］.J Immunol Methods，2009，341(1－2):146－153.

［25］Abouzid K，Ndeboko B，Durantel S，et al.Genetic vaccination for production of DNA－designed antibodies specific to Hepadnavirus envelope proteins［J］.Vaccine，2006，24(21):4615 －4617.