趙 芹, 謝大森, 何曉明, 羅少波, 彭慶務(wù), 陳俊秋
(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所, 廣東 廣州 510640)
瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列的克隆與特征分析
趙 芹①,②, 謝大森①, 何曉明, 羅少波, 彭慶務(wù), 陳俊秋
(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所, 廣東 廣州 510640)
以瓠瓜〔Lagenariasiceraria(Molina) Standl.〕品種‘大籽葫蘆’(‘Dazihulu’)和‘雜交瓠瓜’(‘Hybrid bottle gourd’)為供試材料,對(duì)其基因組總DNA中的LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列進(jìn)行擴(kuò)增,并對(duì)30個(gè)克隆產(chǎn)物的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)、同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明:瓠瓜品種‘大籽葫蘆’與‘雜交瓠瓜’的基因組總DNA均包含長(zhǎng)度約580 bp的RT序列片段。從2個(gè)瓠瓜品種中獲得的30條LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列(編號(hào)為L(zhǎng)sRT1至LsRT30)長(zhǎng)度為564~599 bp,堿基A、T、G和C的數(shù)量分別為143~193、157~205、104~139和83~134,AT/GC比為1.29~1.76,表現(xiàn)出高度異質(zhì)性。缺失突變和終止密碼子突變是造成瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列長(zhǎng)度差異的主要因素。30條瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列的相似性為47.1%~99.5%,其編碼的氨基酸序列相似性為26.7%~100.0%。根據(jù)核苷酸替代值,30條瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列可分為4個(gè)家族(family),分別包含14、8、1和7條序列。氨基酸序列分析結(jié)果顯示:瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列包含20個(gè)保守氨基酸殘基和多個(gè)半保守氨基酸殘基;有14條氨基酸序列具有終止密碼子突變。Family 1、Family 2和Family 4是可能具有轉(zhuǎn)座活性的逆轉(zhuǎn)座子家族,分別包含8、3和5條無(wú)終止密碼子的RT氨基酸序列。根據(jù)瓠瓜與其他15種植物的LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),瓠瓜與葡萄(VitisviniferaLinn.)和黃瓜(CucumissativusLinn.)等種類(lèi)的LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列有較高同源性。研究結(jié)果表明:瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子是一類(lèi)較古老元件,LINE逆轉(zhuǎn)座子可在瓠瓜與其他種類(lèi)的基因組間橫向傳遞。
瓠瓜; LINE逆轉(zhuǎn)座子; RT序列; 序列分析; 相似性; 系統(tǒng)進(jìn)化
瓠瓜〔Lagenariasiceraria(Molina) Standl.〕為葫蘆科(Cucurbitaceae)1年生攀緣草本植物,主要分布于中國(guó)長(zhǎng)江流域及長(zhǎng)江以南地區(qū),品種十分豐富。瓠瓜易栽培且產(chǎn)量高,嫩瓜柔軟多汁且風(fēng)味可口,是華南地區(qū)蔬菜淡季的重要蔬菜[1-2]。根據(jù)形態(tài)和基因,非洲和亞洲的瓠瓜被分為2個(gè)亞種[3-4]。目前對(duì)瓠瓜種質(zhì)資源研究較少,僅見(jiàn)利用分子標(biāo)記初步分析部分瓠瓜種質(zhì)遺傳多樣性的研究報(bào)道[5-8],但對(duì)瓠瓜不同種質(zhì)的形成及進(jìn)化關(guān)系仍不甚明了。另外,瓠瓜花色、花型、瓜型及抗性等性狀差異很大,但這些性狀的形成機(jī)制尚不明確。
逆轉(zhuǎn)座子在植物中分布廣泛,種類(lèi)多、拷貝數(shù)量高、插入位點(diǎn)專(zhuān)一;逆轉(zhuǎn)座子以RNA為中間產(chǎn)物,反轉(zhuǎn)錄為染色體DNA,在寄主基因組內(nèi)不斷轉(zhuǎn)座增殖,影響寄主基因組的大小、結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化[9]。逆轉(zhuǎn)座子可用于基因組的組成、表達(dá)調(diào)控和功能進(jìn)化分析,以及遺傳連鎖的分子標(biāo)記和生物多樣性評(píng)價(jià)及體細(xì)胞無(wú)性系變異評(píng)估等方面[10-12],是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。外界因素易激活逆轉(zhuǎn)座子,進(jìn)而導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)座子發(fā)生基因突變、基因組擴(kuò)增及重排等,并最終引起植物的遺傳變異[13-16],有關(guān)葡萄(VitisviniferaLinn.)果皮顏色及菜豆(PhaseolusvulgarisLinn.)花色形成的研究[17-18]即證實(shí)了這一點(diǎn)。因此,研究瓠瓜的特異生物學(xué)性狀及遺傳進(jìn)化與逆轉(zhuǎn)座子的關(guān)系具有十分重要的意義。
逆轉(zhuǎn)座子包括長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminal repeat,LTR)逆轉(zhuǎn)座子和非長(zhǎng)末端重復(fù)序列(non-long terminal repeat,non-LTR)逆轉(zhuǎn)座子,其中LINEs(long interspersed nuclear elements)逆轉(zhuǎn)座子為非長(zhǎng)末端重復(fù)序列逆轉(zhuǎn)座子之一[19-20]。迄今non-LTR類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子已被廣泛應(yīng)用于多種植物的多個(gè)研究領(lǐng)域[11,21-23],但目前尚未見(jiàn)瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列分離及轉(zhuǎn)錄活性研究的報(bào)道。本文對(duì)瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列及其相互關(guān)系進(jìn)行研究,以期為瓠瓜種質(zhì)資源的分子鑒定、種質(zhì)評(píng)價(jià)與遺傳進(jìn)化研究奠定基礎(chǔ)。
1.1 材料
供試材料為瓠瓜品種‘大籽葫蘆’(‘Dazihulu’)和‘雜交瓠瓜’(‘Hybrid bottle gourd’),均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所瓜類(lèi)研究一室保存。將2個(gè)瓠瓜品種的種子播種于營(yíng)養(yǎng)盤(pán)內(nèi)并置于溫室中培養(yǎng),待幼苗長(zhǎng)至2片真葉時(shí)采集葉片供試。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取及逆轉(zhuǎn)錄酶序列PCR擴(kuò)增 采用改良CTAB法[8,24]提取瓠瓜基因組總DNA,用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳及GENEQUANT納米紫外分光光度計(jì)(德國(guó)Eppendorf公司)檢測(cè)DNA濃度及純度。
參照Hill等[21]的方法合成擴(kuò)增LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列所需的引物。上游引物L(fēng)INE-F的序列為5′-GGGATCCNGGNCCNGAYGGNWT-3′,下游引物L(fēng)INE-R的序列為5′-SWNARNGGRTCNCCYTG-3′,其中N為A/C/G/T,Y為C/T, W為A/T, S為C/G,R為A/G。PCR反應(yīng)體系包含50 ng DNA、2.5 μL 10×Exbuffer(含MgCl2)、1.0 μmol·L-1上游和下游引物、0.20 mmol·L-1dNTPs、1 UExTaqDNA聚合酶,用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);最后于72 ℃延伸10 min。用GeneAmp PCR System 9700型擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并用GeneGeniusBio Imaging System凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)觀察和拍照。
1.2.2 PCR產(chǎn)物克隆及序列測(cè)定 回收純化PCR產(chǎn)物,與pMD19-T Vector連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞并培養(yǎng)過(guò)夜;用Amp抗生素與IPTG及底物X-gal進(jìn)行藍(lán)白斑篩選;挑取白斑,利用M13通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并鑒定出陽(yáng)性克隆,送至廣州英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄酶序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 利用NCBI VecScreen程序去除序列的載體部分,并用NCBI BLASTx程序同源比對(duì)推導(dǎo)獲得RT片段序列及氨基酸序列;應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行序列長(zhǎng)度、堿基組成、AT/GC比、氨基酸序列和多重比對(duì)等分析;結(jié)合GenBank報(bào)道的其他植物的RT序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
2.1 瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列的擴(kuò)增與序列分析
利用簡(jiǎn)并引物從瓠瓜品種‘大籽葫蘆’與‘雜交瓠瓜’的基因組總DNA中均獲得長(zhǎng)度約580 bp的特異片段(圖1),預(yù)期的片段長(zhǎng)度與甜菜(BetavulgarisLinn.)[25]和牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)[26]的LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列基本一致,說(shuō)明該類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子在瓠瓜中普遍存在。
將PCR產(chǎn)物回收克隆,隨機(jī)挑取32個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,去除1條重復(fù)序列。用NCBI BLASTx程序進(jìn)行同源搜索,結(jié)果顯示:有30條序列與已報(bào)道的其他種類(lèi)的non-LTR逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列具有較高的同源性,且均含有RT保守結(jié)構(gòu)域,其中11條來(lái)自品種‘大籽葫蘆’、19條來(lái)自品種‘雜交瓠瓜’。說(shuō)明這些來(lái)源于瓠瓜的克隆均為L(zhǎng)INE逆轉(zhuǎn)座子RT序列,依次命名為L(zhǎng)sRT1至LsRT30。
M: DL2000 DNA marker; 1: 品種‘大籽葫蘆’ Cultivar ‘Dazihulu’; 2: 品種‘雜交瓠瓜’ Cultivar ‘Hybrid bottle gourd’.
圖1 瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列的PCR擴(kuò)增圖譜
Fig. 1 PCR amplification pattern of RT nucleotide sequence of LINE retrotransposon fromLagenariasiceraria(Molina) Standl.
2.2 瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列的相似性分析
DNAStar軟件分析結(jié)果表明(表1):30條瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列的長(zhǎng)度并不完全一致,變化范圍為564~599 bp,其中,LsRT10序列最長(zhǎng)、LsRT2序列最短,其余序列長(zhǎng)度為577~591 bp。堿基分析結(jié)果顯示:30條RT核苷酸序列均富含堿基A和T,AT/GC比為1.29~1.76,A、T、G和C的數(shù)量分別為143~193、157~205、104~139和83~134。
30條瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列的相似性為47.1%~99.5%(表2),其中LsRT3與LsRT4的核苷酸序列相似性最高、LsRT10與LsRT26的核苷酸序列相似性最低(表2,圖2)。由此可見(jiàn),同一引物擴(kuò)增所得的LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列并不一致,在序列長(zhǎng)度、堿基組成及序列相似性等方面存在較大差異,反映出瓠瓜同一類(lèi)群逆轉(zhuǎn)座子的高度異質(zhì)性。甜菜和牡丹等其他植物也有類(lèi)似特點(diǎn)[25-26]。
2.3 瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析
為闡明瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列間的相互關(guān)系,利用MegAlign程序?qū)寺~@得的瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。根據(jù)核苷酸替代值,30條RT核苷酸序列可分為4個(gè)家族(Family 1、Family 2、Family 3和Family 4),其中LsRT25核苷酸序列單獨(dú)列為1個(gè)家族(Family 3),與其他家族的遺傳距離較遠(yuǎn);Family 1、Family 2和Family 4分別包含14、8和7條序列,分別占序列總數(shù)的46.7%、26.7%和23.3%。Family 1包含的14條序列的相似性為55.2%~99.3%,其中僅LsRT2與LsRT10核苷酸序列長(zhǎng)度差異較大,其余序列的長(zhǎng)度均較一致,但存在由不同程度堿基替換、點(diǎn)突變與缺失突變導(dǎo)致的少許差異性(圖2);Family 1又可分為2個(gè)亞家族,分別包含9和5條RT核苷酸序列,其中LsRT12與LsRT22、LsRT13與LsRT21核苷酸序列的相似性最高,推測(cè)可能是在進(jìn)化過(guò)程中由同一類(lèi)逆轉(zhuǎn)座子發(fā)生突變?cè)斐傻摹amily 2包含8個(gè)序列,相似性為58.5%~99.5%,該家族又可分為2個(gè)亞家族,分別包含7和1條RT核苷酸序列,其中LsRT3與LsRT4的核苷酸序列相似性最高,該家族序列間同樣存在缺失突變、堿基替換與點(diǎn)突變(圖2)。Family 4包含7條RT核苷酸序列,相似性為97.6%~99.3%,其中LsRT29與LsRT24的核苷酸序列相似性最高。由此可見(jiàn),堿基替換、點(diǎn)突變或缺失插入突變可能是同一家族逆轉(zhuǎn)座子異質(zhì)性的原因之一。此外,不同家族包含的序列數(shù)量不同,也反映了其轉(zhuǎn)座過(guò)程的差異性。
表1 瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列的長(zhǎng)度和組成比較
Table 1 Comparison on length and composition of RT nucleotide sequence of LINE retrotransposon fromLagenariasiceraria(Molina) Standl.
表2 瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列及氨基酸序列的相似性1)
Table 2 Similarity of RT nucleotide sequence and amino acid sequence of LINE retrotransposon fromLagenariasiceraria(Molina) Standl.1)
續(xù)表2 Table 2 (Continued)
1)橫線下方的數(shù)值為核苷酸序列間的相似性,橫線上方的數(shù)值為氨基酸序列間的相似性 Datums below the diagonal are similarity among nucleotide sequences and those above the diagonal are similarity among amino acid sequences.
2.4 瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列分析和相似性分析
利用NCBI BLASTx程序進(jìn)行同源搜索,依據(jù)與瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列相似性較高的其他物種的RT氨基酸序列,對(duì)30條瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列進(jìn)行推導(dǎo)翻譯,其中LsRT11和LsRT28核苷酸序列從第2個(gè)核苷酸開(kāi)始翻譯,其他序列則從第3個(gè)核苷酸開(kāi)始翻譯。分析結(jié)果表明(圖4):瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列包含20個(gè)保守氨基酸殘基,分別為第12(Phe)、第51(Lys)、第62(Arg)、第64(Ile)、第65(Ser)、第66(Leu)、第71(Tyr)、第72(Lys)、第82(Leu)、第94(Gln)、第96(Ala)、第97(Phe)、第101(Arg)、第103(Ile)、第105(Asp)、第112(Glu)、第124(Gly)、第132(Lys)、第133(Leu)和第147(Leu)位,推測(cè)這些位點(diǎn)可能是瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列中非常保守的位點(diǎn);另外還存在多個(gè)半保守氨基酸殘基,如第78(Leu)、第81(Arg)、第83(Lys)、第134(Asp)和第137(Lys)位等。有14條序列存在終止密碼子突變,其中LsRT25氨基酸序列存在3個(gè)終止密碼子突變(第8、第93和第192位氨基酸);LsRT11和LsRT28氨基酸序列存在2個(gè)終止密碼子突變,前者為第18和第25位氨基酸,后者為第169和第171位氨基酸;存在1個(gè)終止密碼子突變的氨基酸序列包括LsRT1(第158位氨基酸)、LsRT2(第158位氨基酸)、LsRT5(第24位氨基酸)、LsRT10(第139位氨基酸)、LsRT12(第137位氨基酸)、LsRT16(第137位氨基酸)、LsRT17(第137位氨基酸)、LsRT18(第16位氨基酸)、LsRT22(第139位氨基酸)、LsRT23(第158位氨基酸)和LsRT26(第147位氨基酸);有16條氨基酸序列無(wú)終止密碼子,但可能具有轉(zhuǎn)錄活性,包括LsRT3、LsRT4、LsRT6至LsRT9、LsRT13至LsRT15、LsRT19至LsRT21、LsRT24、LsRT27、LsRT29和LsRT30,占瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列數(shù)量的53.3%。因此,終止密碼子突變可能是逆轉(zhuǎn)座子發(fā)生突變與停止表達(dá)、進(jìn)而導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)座子異質(zhì)性的重要原因。
由表2還可以看出:經(jīng)DNAStar軟件MegAlign程序同源比對(duì),30條瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列的相似性為26.7%~100.0%;其中,LsRT11與LsRT10氨基酸序列相似性最低,而二者核苷酸序列的相似性卻達(dá)到47.5%;LsRT3與LsRT4、LsRT6與LsRT30、LsRT13與LsRT21、LsRT24與LsRT29的氨基酸序列相似性均為100.0%,其核苷酸序列相似性分別為99.5%、99.1%、99.3%和99.3%。結(jié)合圖3可見(jiàn),F(xiàn)amily 1中LsRT12與LsRT22核苷酸序列的遺傳距離最近、其相似性為99.3%,氨基酸序列的相似性為99.5%;Family 2中LsRT8與LsRT17核苷酸序列的遺傳距離最近、其相似性為98.5%,氨基酸序列的相似性為97.4%;Family 4中LsRT5與LsRT27核苷酸序列的遺傳距離最近、其相似性為98.1%,氨基酸序列的相似性為97.9%。瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列各家族所包含的序列數(shù)目越多、相似性越高,表明發(fā)生轉(zhuǎn)座的時(shí)間越近,具轉(zhuǎn)座活性的可能性也越大。Family1、Family 2和Family 4分別包含8、3和5條無(wú)終止密碼子的RT氨基酸序列,因此可能是具有轉(zhuǎn)座活性的家族。
2.5 瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析
將30條瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列與GenBank上登錄的其他15種植物的LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),結(jié)果見(jiàn)圖5。瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列與葡萄(CAN76892)、擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.,AAB48348〕、黃瓜(CucumissativusLinn.,XP_004142331)等種類(lèi)的LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列具有較高相似性,相似性為41%~59%。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),可將涉及的RT氨基酸序列聚為4組:LsRT1、LsRT2、LsRT5至LsRT7、LsRT9、LsRT10、LsRT12至LsRT15、LsRT18至LsRT25、LsRT27、LsRT29和LsRT30等22條氨基酸序列與黃瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列遺傳距離較近,聚為第1組(Group Ⅰ),該組包含的瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列數(shù)約占瓠瓜RT氨基酸序列總數(shù)的73.33%;第3組(Group Ⅲ)僅包含1條水稻(OryzasativaLinn.,EEE59033)LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列;第4組(Group Ⅳ)僅包含二穗短柄草〔Brachypodiumdistachyon(Linn.) P. Beauv.,XP_003579203〕LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列,與其他組的遺傳距離最遠(yuǎn);LsRT3、LsRT4、LsRT8、LsRT11、LsRT16、LsRT17、LsRT26和LsRT28等8條氨基酸序列與其他12種植物的LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列聚為第2組(Group Ⅱ),它們的進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較近。30條瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列主要集中在Group Ⅰ與Group Ⅱ中,說(shuō)明瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列兼具一定的保守性與較高的異質(zhì)性。上述分析結(jié)果表明:不同植物種類(lèi)間存在起源相同或相近的逆轉(zhuǎn)座子;由于30條瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列相似性為26.7%~100.0%,因此不同種屬間逆轉(zhuǎn)座子的相似性可能比種屬內(nèi)更高。由此可見(jiàn),瓠瓜與上述植物在進(jìn)化過(guò)程中可能存在LINE逆轉(zhuǎn)座子的橫向傳遞現(xiàn)象。
逆轉(zhuǎn)座子廣泛散布于植物基因組中,其具有的高異質(zhì)性、高拷貝數(shù)及專(zhuān)一插入位點(diǎn)等特性對(duì)植物基因組結(jié)構(gòu)大小與功能進(jìn)化具有顯著影響,對(duì)研究植物遺傳多樣性、遺傳進(jìn)化及基因克隆也具有重要意義[27]。瓠瓜種質(zhì)資源的鑒定、評(píng)價(jià)及系統(tǒng)進(jìn)化研究是加速品種改良和雜種優(yōu)勢(shì)利用的前提。作者利用LINE逆轉(zhuǎn)座子RT序列簡(jiǎn)并引物從瓠瓜種質(zhì)中擴(kuò)增得到目的片段,擴(kuò)增獲得的30條瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列長(zhǎng)度為564~599 bp,長(zhǎng)度差為35 bp,其堿基組成與AT/GC比也存在較大差異。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示:30條瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列可劃分為4個(gè)家族(family),但4個(gè)家族的相似性變異范圍較大,最小為1.7%,表現(xiàn)出很高的異質(zhì)性。此外,終止密碼子突變也普遍發(fā)生在瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列中,推測(cè)這是瓠瓜逆轉(zhuǎn)座子高度異質(zhì)性的主要原因之一,與牡丹和甜菜等作物逆轉(zhuǎn)座子的豐富多態(tài)性及形成原因相似[26-27]。由于30條瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列為隨機(jī)挑選克隆所得,目前尚未在30條RT序列中發(fā)現(xiàn)移碼突變,而移碼突變?cè)谠S多物種的逆轉(zhuǎn)座子RT序列普遍存在,因此,還需進(jìn)一步研究瓠瓜RT序列中移碼突變發(fā)生的可能性。以上分析結(jié)果表明:瓠瓜基因組的LINE逆轉(zhuǎn)座子是一類(lèi)較古老元件,其異質(zhì)性是后來(lái)伴隨寄主基因組的進(jìn)化在轉(zhuǎn)座與世代傳遞過(guò)程中逐漸積累突變的。
30條瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT核苷酸序列分布于4個(gè)家族中,4個(gè)家族包含的RT核苷酸序列數(shù)量不同,表明其轉(zhuǎn)錄過(guò)程存在差異以及家族歷史久遠(yuǎn)程度不同。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示:其中14條序列存在終止密碼子突變,而另外16條可能具有轉(zhuǎn)錄活性的序列則分布于3個(gè)家族中,表明這些家族可能新近發(fā)生過(guò)轉(zhuǎn)座整合事件,目前還具有轉(zhuǎn)座活性[28],可進(jìn)一步用于瓠瓜種下變異的研究。Family 3僅包含1條RT核苷酸序列,與其他家族親緣關(guān)系較遠(yuǎn),表明該家族成員可能由其他家族成員突變而來(lái)或經(jīng)橫向傳遞進(jìn)入瓠瓜基因組,因此相對(duì)較“年輕”;另外,鑒于克隆數(shù)目有限,也存在尚未分離其他成員的可能。植物體內(nèi)的逆轉(zhuǎn)座子易受到生物和非生物脅迫而激活其轉(zhuǎn)錄活性[29-33],因此明確瓠瓜性狀變異與逆轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性之間的關(guān)系,對(duì)于挖掘瓠瓜種質(zhì)的優(yōu)良基因具有重要意義。
逆轉(zhuǎn)座子的縱向傳遞與橫向傳遞是推測(cè)逆轉(zhuǎn)座子起源、物種形成及其與物種相互關(guān)系的重要工具[34-35]。Voytas等[36]認(rèn)為,植物逆轉(zhuǎn)座子序列的種內(nèi)異質(zhì)性差異可能大于種屬間。瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列的相似性為26.7%~100.0%,家族內(nèi)部某些序列間的相似性極高,可能是寄主基因組與逆轉(zhuǎn)座子間互惠關(guān)系的體現(xiàn);而與葡萄和擬南芥等種類(lèi)LINE逆轉(zhuǎn)座子RT氨基酸序列的相似性為41%~59%,說(shuō)明瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子雖較保守,但種內(nèi)異質(zhì)性差異高于種屬間,可能是在進(jìn)化歷史上瓠瓜LINE逆轉(zhuǎn)座子通過(guò)橫向傳遞進(jìn)入其他種類(lèi)的基因組內(nèi),由此也可說(shuō)明生物物種源于共同祖先。
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(責(zé)任編輯: 張明霞)
Cloning and characteristic analysis on RT sequence of LINE retrotransposon fromLagenariasiceraria
ZHAO Qin①,②, XIE Dasen①, HE Xiaoming, LUO Shaobo, PENG Qingwu, CHEN Junqiu
(Vegetable Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China),
J.PlantResour. &Environ., 2015, 24(1): 1-11
Taking cultivars ‘Dazihulu’ and ‘Hybrid bottle gourd’ ofLagenariasiceraria(Molina) Standl. as tested materials, RT sequence of LINE retrotransposon in their genomic total DNA was amplified, and alignment, homology analysis and phylogeny analysis of nucleotide sequence of 30 cloning products and their amino acid sequences encoded were carried out. The results show that genomic total DNA of both ‘Dazihulu’ and ‘Hybrid bottle gourd’ includes RT sequence fragment with length about 580 bp. Length of 30 RT nucleotide sequences (Nos. from LsRT1 to LsRT30) of LINE retrotransposon obtained from the two cultivars is 564-599 bp, base number of A, T, G and C is 143-193, 157-205, 104-139 and 83-134, respectively and AT/GC ratio is 1.29-1.76, which shows high heterogeneity. The main factors inducing difference in length of RT nucleotide sequence of LINE retrotransposon fromL.sicerariaare deletion mutation and stop codon mutation. Similarity of 30 RT nucleotide sequences of LINE retrotransposonfromL.sicerariais 47.1%-99.5%, and thatofaminoacidsequenceencodedis 26.7%-100.0%. Based on nucleotide substitution, 30 RT nucleotide sequences of LINE retrotransposon fromL.sicerariacan be divided into four families, which contains 14, 8, 1 and 7 sequences, respectively. The analysis result on amino acid sequence shows that RT amino acid sequence of LINE retrotransposon fromL.sicerariacontains 20 conservative amino acid residues and many semi-conservative amino acid residues, and 14 amino acid sequences possess stop codon mutation. Family 1, Family 2 and Family 4 may be the retrotransposon families with transposition activity, and include 8, 3 and 5 RT amino acid sequences without stop codon, respectively. According to phylogenetic tree constructed on RT amino acid sequence of LINE retrotransposon fromL.sicerariaand other 15 species, there is higher homology in RT amino acid sequence of LINE retrotransposon fromL.sicerariawith those fromVitisviniferaLinn.,CucumissativusLinn. and other species. It is suggested that LINE retrotransposon fromL.sicerariais a more ancient element, and can be horizontally transferred among genome ofL.sicerariaand other species.
Lagenariasiceraria(Molina) Standl.; LINE retrotransposon; RT sequence; sequence analysis; similarity; phylogeny
2014-06-24
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31311643); 廣東省自然科學(xué)基金博士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(10451064001006063); 廣州市珠江科技新星專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目(2013086)
趙 芹(1982—),女,山東泰安人,博士,副研究員,主要從事瓜類(lèi)遺傳育種與分子生物技術(shù)方面的研究。
謝大森(1970—),男,江西遂川人,博士,研究員,主要從事瓜類(lèi)抗病育種與生物技術(shù)方面的研究。
Q785; S642.9
A
1674-7895(2015)01-0001-11
10.3969/j.issn.1674-7895.2015.01.01
①并列第一作者
②通信作者 E-mail: zhaoqin0802@126.com