周曉波，趙成鵬，王鎏，張朋，唐旭，段永福

（河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院小兒外科，河南 南陽(yáng) 473000）

·論著·

腫瘤抑素影響嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡的相關(guān)機(jī)制

周曉波，趙成鵬，王鎏，張朋，唐旭，段永福

（河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院小兒外科，河南 南陽(yáng) 473000）

目的觀察腫瘤抑素對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法采用0、5、10、20和40μg/ml的腫瘤抑素及40μg/ml的腫瘤抑素處理嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞0、12、24和48 h，采用MTT方法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及凋亡情況。采用Western blot方法檢測(cè)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK和mTOR的磷酸化水平。結(jié)果同0μg/ml腫瘤抑素處理組相比，5、10、20和40μg/ml的腫瘤抑素均可顯著抑制嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力，并促進(jìn)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡（P＜0.05），且這種作用具有計(jì)量依賴性。同0 h處理組相比，40μg/ml的腫瘤抑素處理嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞2、24和48 h均可顯著抑制嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力，并促進(jìn)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡（P＜0.05），且這種作用具有時(shí)間依賴性。同對(duì)照相比，腫瘤抑素可上調(diào)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK的磷酸化水平，下調(diào)mTOR的磷酸化水平。結(jié)論腫瘤抑素可通過(guò)激活A(yù)MPK通路，進(jìn)而抑制mTOR通路，從而抑制嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力，并促進(jìn)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

腫瘤抑素；嬰幼兒血管瘤；內(nèi)皮細(xì)胞；增殖；凋亡

嬰幼兒血管瘤是嬰幼兒最常見(jiàn)的良性腫瘤，其發(fā)病率約為4%～12%。目前針對(duì)嬰幼兒血管瘤的治療方法包括類固醇激素治療和常規(guī)抗腫瘤藥物治療等[1]。血管生成是嬰幼兒血管瘤發(fā)生的先決條件，其在嬰幼兒血管瘤快速生長(zhǎng)中發(fā)揮重要的作用[1]。腫瘤抑素（tumstatin）是新近發(fā)現(xiàn)的一種起源于血管基底膜IV型膠原的內(nèi)源性血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子[2-4]，由244個(gè)氨基酸組成，分子量約為28 kD。腫瘤抑素是一種很強(qiáng)的血管生成抑制因子，可選擇性地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，是目前發(fā)現(xiàn)的一種具有良好的應(yīng)用前景的抗血管生成和抗腫瘤藥物[5]。然而，目前關(guān)于腫瘤抑素在嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮發(fā)生發(fā)展中的作用，以及腫瘤抑素發(fā)揮作用的機(jī)制還很少有文獻(xiàn)報(bào)道。據(jù)此，本研究通過(guò)體外分離獲取嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，觀察了腫瘤抑素對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并對(duì)腫瘤抑素發(fā)揮作用的機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。

1 材料與方法

1.1主要試劑

p-AMPK抗體和p-mTOR抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG購(gòu)自Snata Cruz公司，Cyto-Buster蛋白提取試劑購(gòu)自Novagen公司，蛋白酶和磷酸酶抑制劑購(gòu)自Thermo公司。

1.2嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞獲取及鑒定

嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞獲取及鑒定方法參見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道[1]。

1.3細(xì)胞處理

采用0、5、10、20和40μg/ml的腫瘤抑素及40μg/ml的腫瘤抑素處理嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞0、12、24和48 h。

1.4MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

上述腫瘤抑素處理的細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于96孔培養(yǎng)板中，采用不同濃度和不同時(shí)間的腫瘤抑素處理嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞后，每孔中加入20μl的MTT溶液，作用4 h后吸出上清，加入150μl的二甲基亞砜（DMSO）溶液，低速震蕩10 min后，波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定OD值。

1.5凋亡檢測(cè)

收集上述腫瘤抑素處理細(xì)胞離心，1 000×g離心5 min，以含1%BSA的磷酸緩沖液（PBS）洗滌1次。用100μl Binding緩沖液將細(xì)胞重懸，加入2μl Annexin V染料和0.1μl PI染料，避光15 min，以含1%BSA的PBS洗滌2次。

1.6細(xì)胞總蛋白提取

上述細(xì)胞采用冰PBS洗滌2次，400×g離心，5 min；棄去細(xì)胞上清，于沉淀中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑和CytoBuster蛋白提取試劑，吹打混勻，室溫放置15 min；4℃，12 000×g離心15 min；所得上清部分即細(xì)胞總蛋白，留部分細(xì)胞總蛋白檢測(cè)蛋白濃度，其余每管15μl分裝，-80℃凍存。

1.7BCA法測(cè)定蛋白濃度

嚴(yán)格按BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品BSA的稀釋；按體積比為50∶1混合試劑盒中的試劑A和試劑B，即為工作液；96孔板中每孔加入200μL的工作液，隨后加入25μl倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，每種樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。37℃孵育30 min后波長(zhǎng)562 nm處測(cè)定OD值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值和濃度梯度繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣品的OD值推算出樣品濃度。

1.8Western blot

等量的提取上述蛋白經(jīng)8%～10%SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠分離后，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，采用含5%BSA的TBST室溫孵育封閉2 h，加入鼠抗人p-AMPK抗體或p-mTOR抗體，4℃過(guò)夜孵育。次日以0.1%TBST洗膜3次，每次5 min，加入相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST洗膜后，采用Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化學(xué)發(fā)光底物對(duì)條帶進(jìn)行顯色。Actin作為內(nèi)參對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。使用Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1腫瘤抑素對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，隨著腫瘤抑素濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力逐漸降低（P＜0.01）。

2.2腫瘤抑素對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，隨著腫瘤抑素濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平逐漸升高（P＜0.01）。

2.3 腫瘤抑素對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK蛋白磷酸化水平的影響

如圖3所示，隨著腫瘤抑素濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK蛋白磷酸化水平逐漸升高。

2.4腫瘤抑素對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中mTOR蛋白磷酸化水平的影響

如圖4所示，隨著腫瘤抑素濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中mTOR蛋白磷酸化水平逐漸降低。

3 討論

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶。細(xì)胞在接受外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子信號(hào)刺激后，均可通過(guò)mTOR信號(hào)通路向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)。同時(shí)，mTOR信號(hào)通路的活化水平還受AMPK（AMP激活的蛋白質(zhì)激酶，AMP activated potein kinase）活化水平的的調(diào)節(jié)[6-7]。研究顯示，p53可通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/ mTOR信號(hào)通路的活化水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[8-9]。同時(shí)，AMPK/mTOR信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、存活、自噬、凋亡等生理過(guò)程中也具有重要的作用[10]。據(jù)此，本研究觀察了AMPK/mTOR信號(hào)通路在腫瘤抑素（tumstatin）調(diào)節(jié)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡水平中的作用。腫瘤抑素是新近發(fā)現(xiàn)的一種具有很強(qiáng)的抑制血管生成作用的因子，可選擇性地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[5]。本研究通過(guò)分離獲取嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，在體外采用不同濃度的腫瘤抑素及相同濃度的腫瘤抑素處理嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間，以觀察腫瘤抑素對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡水平中的作用。結(jié)果顯示，在體外采用0、5、10、20和40μg/ml的腫瘤抑素及40μg/ml的腫瘤抑素處理嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞0、12、24和48 h，與對(duì)照組相比，腫瘤抑素可顯著抑制嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并促進(jìn)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，且此作用具有劑量及時(shí)間依賴性。進(jìn)一步對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路在腫瘤抑素調(diào)控嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡中的作用研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑素可上調(diào)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞中AMPK的磷酸化水平，下調(diào)mTOR的磷酸化水平，且此作用同樣具有劑量及時(shí)間依賴性。腫瘤抑素的這種通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)通路調(diào)控嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的作用與文獻(xiàn)報(bào)的亞硒酸鈉可通過(guò)調(diào)控結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞中AMPK及其下游靶蛋白mTOR而對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響的結(jié)果相一致[11]。綜述所述，本研究結(jié)果提示，腫瘤抑素可通過(guò)調(diào)AMPK/mTOR信號(hào)通路的活化水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡水平。然而，關(guān)于其他信號(hào)通路分子，如p53分子是否在腫瘤抑素調(diào)控嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡中具有一定的作用還需進(jìn)一步的深入研究。

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Effect of tumstatin on proliferation and apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma

Xiao-bo ZHOU,Cheng-peng ZHAO,Liu WANG,Peng ZHANG,Xu TANG,Yong-fu DUAN
(Department of Pediatrics Surgery,Nanyang Central Hospital,Nanyang,Henan 473000,P.R.China)

【Objective】To observe the effect of tumstatin on proliferation and apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma,and study the related mechanism.【Methods】Endothelial cell in infantile hemangioma was treated with tumstatin with different concentrations(0,5,10,20 and 40 μg/ml)or in a time dependent manner(0, 12,24 and 48 h),then the proliferation ability and apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma were detected by MTT and FCM,phosphorylation level of AMPK and mTOR were detected by Western blot.【Results】Compared with 0 μg/ml tumstatin treated group,5,10,20 and 40 μg/ml tumstatin treated can inhibit proliferation in endothelial cell in infantile hemangioma,and promote apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma(P＜0.05),and those effect were concentration dependent.Compared with 0 h tumstatin treated group,12,24 and 48 h tumstatin treated can inhibit proliferation in endothelial cell in infantile hemangioma,and promote apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma(P＜0.05),and those effect were time dependent.Compared with control group,tumstatin treated can active AMPK signaling pathway and inhibit mTOR signaling pathway in endothelial cell in infantile hemangioma.【Conclusion】By active AMPK signaling pathway and inhibit mTOR signaling pathway, tumstatin can inhibit proliferation in endothelial cell in infantile hemangioma,and promote apoptosis of endothelial cell in infantile hemangioma.

tumstatin;infantile hemangioma;endothelial cell;proliferation;apoptosis

R730

A

1005-8982（2015）28-0017-05

2015-04-26