馮 靜 楊 青

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128）

豬細(xì)小病毒體外培養(yǎng)研究進(jìn)展

馮 靜 楊 青*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128）

豬細(xì)小病毒是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一。細(xì)胞培養(yǎng)法是體外分離純化病原最基本的方法。本文介紹了病毒細(xì)胞模型的建立、細(xì)胞模型在病毒診斷中的應(yīng)用、病毒在細(xì)胞培養(yǎng)模型上培養(yǎng)條件的優(yōu)化等，并分析了病毒與細(xì)胞模型相互作用、抗病毒藥物在細(xì)胞模型上的研究進(jìn)展。

豬細(xì)小病毒 細(xì)胞模型 病毒診斷 抗病毒

豬細(xì)小病毒（PPV）是造成母豬繁殖障礙的主要因素之一，嚴(yán)重影響母豬的繁殖能力。豬細(xì)小病毒感染宿主后，早期引起胚胎死亡，產(chǎn)仔數(shù)少或?qū)遗洳辉?；中期產(chǎn)木乃伊胎，后期產(chǎn)仔正常，但仔豬攜帶PPV病毒。細(xì)小病毒只感染豬，大小豬都易感，但僅初產(chǎn)豬表現(xiàn)癥狀。目前成世界流行趨勢，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PPV于1967年由Cartwright等在研究豬繁殖障礙性疾病時(shí)分離并首次發(fā)現(xiàn)其致病性[7]，在我國1983年首次分離到。研究者通過系統(tǒng)或局部等人工感染PPV的方式構(gòu)建了許多動物模型，并對PPV致病性及其感染所致的組織病變等進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)PPV可在多數(shù)動物組織和細(xì)胞（原代和傳代細(xì)胞）中增殖，能引起較明顯的組織和細(xì)胞病變，常作為模式病毒用于病毒感染機(jī)制和藥物的抗病毒作用研究。

動物模型可以觀察PPV對機(jī)體的侵害，造成的病理變化部位，也不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，操作簡單，但實(shí)驗(yàn)動物個(gè)體差異大，且價(jià)格昂貴，還需準(zhǔn)備畜舍，實(shí)驗(yàn)中受環(huán)境因素影響大，不可控因素多。相對于動物模型，構(gòu)建細(xì)胞模型能有效地彌補(bǔ)動物模型的不足。由于細(xì)胞的生理特性的一致性，對病毒的易感性不存在差異，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好；而且細(xì)胞培養(yǎng)方便、經(jīng)濟(jì)、周期短，可以嚴(yán)格的執(zhí)行無菌操作；另外，細(xì)胞培養(yǎng)能顯示病毒的生長特征，采用空斑技術(shù)能對病毒進(jìn)行克隆化。對病毒分子生物學(xué)特性研究，發(fā)病機(jī)制的研究、疫苗研制和抗病毒藥物篩選都離不開體外細(xì)胞培養(yǎng)模型。

1 病毒體外培養(yǎng)的條件研究

PPV對宿主細(xì)胞有一定的選擇性，一般在豬原代細(xì)胞上如豬腎、豬睪丸細(xì)胞及傳代細(xì)胞（如 PK-15、ST和IBRS2等）和人的某些傳代細(xì)胞（如 Hela，KB，Hep-2和Lul32等）上生長繁殖。Oraveerakul（1992）等比較了NADL-8、NADL-2、KBSH和 Kresse 4株P(guān)PV病毒株在不同細(xì)胞系中的復(fù)制情況，除了使用常用的來源于豬睪丸和豬腎的細(xì)胞系，研究中還使用了來自牛胎肺、牛皮膚、牛胎兒皮膚、牛腎、犬腎、綠猴腎、牛胎兒睪丸、狼皮膚、豬輸卵管、綠猴腎、幼倉鼠腎、羊胎兒睪丸和人上皮癌細(xì)胞等細(xì)胞系，不同的病毒株在同一細(xì)胞上或者同一病毒株在不同細(xì)胞系上生長復(fù)制情況都不同。而且研究發(fā)現(xiàn)PPV病毒還能在牛、犬和狼的一些細(xì)胞系上生長復(fù)制。

PPV感染細(xì)胞一般有2種途徑，一種是在細(xì)胞傳代時(shí)同時(shí)加入病毒液，由于PPV的復(fù)制依賴細(xì)胞的蛋白質(zhì)和核酸合成體系來完成其病毒粒子的復(fù)制，通常采用同步接毒方式繁殖PPV病毒。這種接毒方式可使易感細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）時(shí)間縮短，也可縮短細(xì)胞盲傳周期。另一種是待細(xì)胞長到70%～80%時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，加入病毒稀釋液，待病毒與細(xì)胞作用一段時(shí)間后再加入細(xì)胞維持液，大多數(shù)病毒采用此種方式接毒。

病毒的體外培養(yǎng)受多種因素的影響，當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)環(huán)境如溫度和氣體環(huán)境、培養(yǎng)基以及血清類型和濃度都決定著細(xì)胞的生長狀況，從而影響病毒的培養(yǎng)。魏戰(zhàn)勇（2005）等將3種豬細(xì)小病毒毒株包括南京毒株1（NJ-1）、NJ-2和7909毒株接種于PK-15細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)3個(gè)毒株的增殖規(guī)律基本相似，在感染后12 h后就可檢測到熒光信號，隨后逐漸增高，在感染48 h時(shí)幾乎所有細(xì)胞都被感染，在感染60 h時(shí)其TCID50均達(dá)最高；在84 h時(shí)病毒引起細(xì)胞大面積崩解，由此可見這3中PPV病毒株在PK-15中收獲較佳的時(shí)間是接種后60 h。該研究進(jìn)一步測定發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中PPV病毒粒子的半壽期為7 h[6]。唐滿華（2013）等摸索了豬細(xì)小病毒M2株在ST細(xì)胞中培養(yǎng)條件并進(jìn)行了優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PPV M2株采用同步接種法相對于單層接種法更具優(yōu)勢。研究比較發(fā)現(xiàn)：在合適的細(xì)胞密度下，在培養(yǎng)基添加含不同血清及血清濃度采用可導(dǎo)致CPE出現(xiàn)的時(shí)間不同，而且毒力也不一樣[4]。Wei（2009）等研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮（Nitric oxide，NO）對豬細(xì)小病毒的體外增殖有一定的影響，用底物S-硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）和L-精氛酸（L-Arg）誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO可使PPV感染細(xì)胞的作用受影響，其抑制效果與NO底物的濃度呈正相關(guān)，而且在一定濃度下SNAP抑制PPV的復(fù)制強(qiáng)于L-Arg；相關(guān)結(jié)果也表明NO的抗病毒作用主要發(fā)生在病毒感染的初始階段[11]。

2 細(xì)胞模型在病毒診斷的應(yīng)用

利用組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)對病毒進(jìn)行分離鑒定是一種常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，通過病毒感染易感細(xì)胞、細(xì)胞病變并結(jié)合一些分子生物學(xué)檢查手段能有效地分離和純化病毒。豬細(xì)小病毒只感染豬，僅初產(chǎn)豬表現(xiàn)癥狀，根據(jù)豬繁殖障礙臨床癥狀診斷時(shí)要與偽狂犬病、豬瘟、乙型腦炎和豬繁殖與呼吸綜合征等病區(qū)分，需要分離病毒進(jìn)行鑒別診斷。病毒分離有動物接種，雞胚培養(yǎng)和組織或細(xì)胞培養(yǎng)法。動物接種如嗜神經(jīng)性病毒（狂犬病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和帶狀皰疹病毒等）可接種于小鼠腦內(nèi)，痘病毒可接種于家兔角膜或皮內(nèi)。雞胚對多種病毒敏感，根據(jù)不同種類病毒，將病毒接種于雞胚的不同部位。Zhang（2010）等在木乃伊和流產(chǎn)胎兒器官中分離到一株病毒，這株病毒能凝集豚鼠，兔和雞的紅細(xì)胞，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）證實(shí)為豬細(xì)小病毒（PPV）。進(jìn)一步將該病毒株通過接種于豬原代腎細(xì)胞和傳代ST細(xì)胞能引起明顯的細(xì)胞病變，并通過ELISA、免疫熒光分析、電鏡觀察以及測序結(jié)果確認(rèn)是PPV BQ株[12]。

3 病毒與細(xì)胞宿主之間作用關(guān)系

非特異性免疫是抵御病毒感染的第一道防線，其通過信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞（如T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等）和某些非免疫細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞等）經(jīng)刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)。病毒感染細(xì)胞過程中，引起細(xì)胞非特異性免疫反應(yīng)，調(diào)控免疫應(yīng)答。

3.1 干擾素

細(xì)胞因子中包括干擾素（IFN），干擾素有2類，分別是I型干擾素（病毒誘導(dǎo)型）和Ⅱ型干擾素（免疫調(diào)節(jié)型）。干擾素是一種廣譜抗病毒劑，主要通過細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白。Wen Lin（2013）等使用熒光定量PCR和熒光素酶報(bào)告基因檢測PPV感染ST細(xì)胞后是否誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素（IFN-α和IFN-β），以及是否阻斷dsRNA誘導(dǎo)IFN-β啟動子的活化。研究顯示 PPV感染ST后不誘導(dǎo)產(chǎn)生I型干擾素且PPV的NS2蛋白阻斷dsRNA誘導(dǎo)IFN-β啟動子的活化[11]。這里的實(shí)驗(yàn)結(jié)果使我們對細(xì)小病毒的發(fā)病機(jī)制理解產(chǎn)生重大影響，也為我們今后研制一類新的抗病毒和抗炎藥物提供參考。李厚偉（2011）等研究發(fā)現(xiàn)PPV感染PK-15細(xì)胞可引起的病毒DNA量的變化，在感染12 h后病毒開始大量迅速增殖，48 h達(dá)到最高峰，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與魏站勇的結(jié)果相同[6]；同時(shí)使許多細(xì)胞因子（如IFN p、IFN 7、IFNAR-1、IFNAR-2、MHC-I、MHC-lI、MXl、iNOS、2-5AS、RNase L和IRF 3）的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加，其中Mxl基因在24 h轉(zhuǎn)錄量達(dá)到8 423倍[2]。

3.2 白細(xì)胞介素

PPV在感染胎兒死亡后可見多種組織和器官有廣泛的細(xì)胞壞死、炎癥和核內(nèi)包涵體。白介素是參與細(xì)胞免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子。病毒接種于細(xì)胞后會引起細(xì)胞病變，為了解豬細(xì)小病毒（PPV）感染Marc-145細(xì)胞后引起細(xì)胞炎性反應(yīng)，黨玉麗等（2011）、劉石等（2011）和張彥桃等（2011）運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)檢測了豬細(xì)小病毒（PPV）感染Marc-145細(xì)胞后引起的病毒DNA含量的變化及白介素的分泌水平。結(jié)果表明白介素IL-6和IL-13的表達(dá)量在l、3和24 h明顯增加，48 h時(shí)下降至低于對照水平；而IL-18的表達(dá)量在1 h無明顯變化、在3～24 h增加，而48 h有下降趨勢[1，3，5]。說明Marc-145細(xì)胞感染豬細(xì)小病毒后可引起IL-6、IL-13和IL-18的增加，細(xì)胞內(nèi)白介素積極參與抵抗病毒的侵染。

4 抗病毒藥物研究

尋找有效的抗病毒藥物是目前很熱門的研究方向，據(jù)報(bào)道甘草酸二銨能有效治療幾種病毒（如人的免疫缺陷病毒、甲型和乙型肝炎病毒、冠狀病毒和皰疹病毒）。Li（2014）等用豬睪丸（ST）細(xì)胞為模型，研究了甘草酸二銨對PPV的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)甘草酸二胺提前處理要感染ST細(xì)胞的PPV病毒時(shí)對PPV病毒有強(qiáng)的抑制作用，且呈劑量依賴性。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果還通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。脫氧膽酸鹽是一種陰離子去除劑，此實(shí)驗(yàn)中被用作對照組，以排除甘草酸二胺充當(dāng)洗滌劑抑制PPV感染的可能性。研究清楚地表明，甘草酸二胺在體外有直接抗PPV效果[9]。Li的研究為豬細(xì)小病的治療開辟了新的研究方向。

5 總結(jié)和展望

體外模型是病毒研究中不可缺少的部分，無論是在病毒結(jié)構(gòu)研究，致病機(jī)理，病情診斷，病毒分離純化等都起著重要作用。迄今建立的PPV感染細(xì)胞模型主要方便了病毒的培養(yǎng)，克隆純化。但是，細(xì)胞模型與病毒入侵機(jī)體還存在一定差距，畢竟機(jī)體的防御機(jī)制與單獨(dú)的細(xì)胞防御存在差異。細(xì)胞模型還受環(huán)境，培養(yǎng)基的影響，最適培養(yǎng)條件有利病毒培養(yǎng)。抗病毒藥物的研究空間很大，今后的研究中應(yīng)研究更多的藥物為防治PPV做出完善。

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國家自然科學(xué)基金（31272630）和教育部博士點(diǎn)基金-新教師類（20114320120006）。

馮靜（1988-），女，碩士研究生，主要研究方向動物生殖醫(yī)學(xué)。

楊青（1976-），女。