于志勇

（湖南省長沙市第八醫(yī)院病理科，湖南 長沙 410100）

左旋肉毒堿對MC3T3-E1成骨細胞及OPG表達的作用

于志勇

（湖南省長沙市第八醫(yī)院病理科，湖南 長沙 410100）

目的 探討左旋肉毒堿對MC3T3-E1成骨細胞及OPG的表達作用，為臨床預(yù)防骨質(zhì)疏松提供參考。方法 以小鼠骨細胞MC3T3-E1成骨細胞為研究對象，用左旋肉毒堿對其表達進行干預(yù)，最后，以免疫組化法檢測左旋肉毒堿干預(yù)前后OPG蛋白質(zhì)表達水平的改變，分析左旋肉毒堿對MC3T3-E1成骨細胞OPG的表達作用。結(jié)果 1 mmol/L左旋肉毒堿對小鼠成骨細胞無明顯作用，10～100 mmol/L左旋肉毒堿能促進小鼠成骨細胞增殖，顯著抑制人成骨細胞凋亡，增加小鼠骨密度。結(jié)論 左旋肉毒堿可通過促進MC3T3-E1成骨細胞OPG的表達，促進成骨細胞增殖，呈劑量依賴性和時間依賴性，并且左旋肉毒堿可抑制人成骨細胞凋亡，延長其存活時間。

左旋肉毒堿；MC3T3-E1；成骨細胞；OPG；骨質(zhì)疏松

左旋肉毒堿（L-C）是人體細胞內(nèi)普遍存在的一種基本成分，人體肝臟、腎臟可合成約1/4的左旋肉毒堿，其余通過食物攝?。?］。有報道表明，左旋肉毒堿可通過促進成骨細胞的表達來促進骨形成，另外，左旋肉毒堿也可對OPG（骨保護素，又稱破骨細胞抑制因子）產(chǎn)生作用，以此來預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。本次探究以小鼠骨細胞MC3T3-E1成骨細胞為研究對象，探討左旋肉毒堿對MC3T3-E1成骨細胞OPG的表達作用，分析左旋肉毒堿促進骨形成的作用機制，報道如下。

1 資料與方法

1.1 成骨細胞培養(yǎng)：在含有10%胎牛血清（FBS）、50 μg/mL抗壞血酸，50 μg/mL慶大霉素和50 U/mL青鏈霉素的培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)小鼠成骨細胞MC3T3-El。保持溫度37 ℃、濕度100%、CO2濃度5%。觀察組以0.1～10 mmol/L左旋肉毒堿培養(yǎng)24 h，對照組加等量蒸餾水作為對照。

1.2 表型鑒定：將細胞接種于24孔板，第2天換含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的無血清α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再換不含BSA的無血清α-MEM培養(yǎng)基，分別以0、1、10、100 mmol/L左旋肉毒堿干預(yù)2 d后，PBS反復(fù)沖洗3次，超聲粉碎裂解細胞，離心、取上清液、測定ALP活性，以骨鈣素放射免疫試劑盒測定上清液中骨鈣素含量（靈敏度為0.2 ng/mL）檢測成骨細胞中OPG蛋白表達變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析處理，計數(shù)資料以表示，用t檢驗，計量資料的比較用χ2檢驗，組間比較用單因素方差分析，檢驗水準取α=0.05，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

10～100 mmol/L左旋肉毒堿促進人成骨細胞增殖。1 mmol/L以下左旋肉毒堿對人成骨細胞增殖無明顯影響（與對照組相比，P＞0.05）。10 mmol/L以上劑量后，左旋肉毒堿使人成骨細胞增殖量隨濃度遞增（與對照組相比，P＜0.05）。另外，實驗組1 mmol/L左旋旋肉毒堿可見細胞核濃縮，核裂解，大量凋亡細胞，隨著左旋肉毒堿劑量增加，實驗組凋亡細胞明顯減少。

3 討 論

人體骨吸收和再生之間的動態(tài)平衡維持著骨代謝的穩(wěn)定，其形成和吸收的速率由成骨細胞和破骨細胞的數(shù)量、活性及存活時間來決定［2］。老年人及絕經(jīng)后的婦女由于分泌、代謝等因素易導(dǎo)致成骨細胞減少、破骨細胞增加引起骨質(zhì)疏松。左旋肉毒堿已經(jīng)被證實可作為長鏈脂肪酸的載體，將期運送至線粒體內(nèi)進行氧化功能，還可促進成骨細胞增殖和分化，增加骨密度預(yù)防骨質(zhì)疏松。

本次探究以小鼠成骨細胞為研究對象，探討左旋肉毒堿對MC3T3-E1成骨細胞及OPG的表達作用，實驗結(jié)果表明，10 mmol/L以上的左旋肉毒堿通過MC3T3-E1成骨細胞OPG蛋白的表達，促進成骨細胞增殖，抑制破骨細胞生成，從而提高骨密度。有文獻報道，左旋肉毒堿是通過下調(diào)Caspase-3、Caspase-9的活化，來抑制成骨細胞凋亡的，從雙方面降低了骨質(zhì)疏松的發(fā)生［3］。說明左旋肉毒堿不僅可以促進成骨細胞增殖、還可以延長其生存時間，緩解其凋亡速率，另外，左旋肉毒堿對OPG表達的抑制作用可抑制破骨細胞生成，對骨重建及骨密度的增加具有重要意義。對老年人及絕經(jīng)后的婦女，可顯著改善其骨質(zhì)量，降低骨折的發(fā)生率［4］。

綜上所述，一定劑量的左旋肉毒堿可促進MC3T3-E1成骨細胞OPG的表達，刺激成骨細胞增殖，且其作用強度呈劑量依賴性和時間依賴性。另一方面，左旋肉毒堿可抑制人成骨細胞凋亡和破骨細胞生成，促進骨形成、減少骨量丟失。本次探究是提高動物實驗證實其作用，具體將左旋肉毒堿應(yīng)用于臨床治療，還有待進一步臨床實驗的證實。

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［2］ 崔蓉蓉，謝輝，黃佼，等.左旋肉毒堿對人成骨細胞增殖和凋亡的影響［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2007，13（10）:681-682.

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［4］ 張勇，楊彤濤，黃立軍，等.人破骨細胞分化因子（ODF）的克隆和序列分析［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2006，35（3）:269-270.

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1671-8194（2015）14-0045-01