王俊峰

(貴州凱里黔東南民族職業(yè)技術學院,貴州黔東南 556000)

綿羊精液冷凍技術及其發(fā)展概況

王俊峰

(貴州凱里黔東南民族職業(yè)技術學院,貴州黔東南 556000)

家畜精液保存技術是20世紀隨著人工授精技術廣泛應用而產(chǎn)生的。原理是通過降低或一致精子新陳代謝強度達到延長精子在體外壽命的目的。由于較高的使用性和可觀的經(jīng)濟效益，在近幾十年得到長足發(fā)展?，F(xiàn)已研究的稀釋液包括檸檬酸鹽——糖類、奶類、蔗糖類、棉籽糖類、三基類和其他含保護劑的抗氧化的溶液。凍精子宮頸輸精的產(chǎn)羔率與冷凍技術和輸精操作有關。本文重點介紹綿羊冷凍精液的保存、人工輸精技術。

1 綿羊的精液冷凍歷史

綿羊精液冷凍保存技術研究開始于20世紀50年代。Emmens（1950）將綿羊精液冷凍到-79℃獲得了較高的存活率。后來，Mkorozzov（1964）[1]和PLKATILOVA（1960）分別用含30%卵黃、16%甘油的高滲卵黃-檸檬酸鹽-葡萄糖-甘油稀釋液和等滲的卵黃-檸檬酸鹽-阿拉伯糖稀釋液都獲得了較高的產(chǎn)羔率。

2 綿羊精液冷凍保存的稀釋液

為了延長精子在體外的存活時間和授精力，便于保存和運輸，常向精液中加入適宜精子存活的稀釋液。對稀釋液的基本要求包括：pH、緩沖性、滲透壓和低溫保護性能。常規(guī)的稀釋液可分為6種：

2.1 檸檬酸鹽-糖類稀釋液

Emmens等（1950）試驗發(fā)現(xiàn)，檸檬酸鹽液加0.9%～1.25%，阿拉伯糖的凍精存活率高。大多研究者發(fā)現(xiàn)提高稀釋液滲透壓可增加凍精存活率。如，Kuznecov等（1959）用高滲的檸檬酸鹽-葡萄糖-卵黃液獲得產(chǎn)羔率提高。

2.2 奶類稀釋液

奶類用于精液冷凍時要加入阿拉伯糖、果糖或卵黃（Blackshaw，1955；……Aumdal 等，1982）。

2.3 乳糖類稀釋液

Marinov等（1983a，1984）證實，乳糖-卵黃液加12%EPC-20或EPC-6（多不飽和脂肪酸與乙二醇的復合物）對精子超微結(jié)構(gòu)保護性較好。Zheltobrjuk等（1981）報道，乳糖-卵黃液中添家5%～6%polyglukine或10%repolyglukine（一種高分子葡萄糖漿合物），凍精存活率和授精率提高。Fiser等（1987～1990）試驗在乳糖-葡萄糖稀釋液中冷凍綿羊精液獲得了可接受的授精率。

2.4 加抗氧化劑的蔗糖類稀釋液

蔗糖作合成稀釋液主要成分是因為蔗糖對精子頂體保護性能優(yōu)于葡萄糖、果糖或乳糖。又由于綿羊精液不像其他畜種其中不含抗氧化劑。因此，通常在蔗糖類稀釋液中添加合成的抗氧化劑，以抑制精子磷脂成分特別是不飽和[廿二碳（22∶6）和廿碳（20∶4）]脂肪酸的過氧化反應。研究證實，維生素E添加到含葡萄糖ETA-Na2或三基的糖類稀釋液中，對精液進行無氧凍前處理效果好（Varnavshkij等，1976；M·lovanov等1976）。Nauk等（1992）報道，乳糖-卵黃稀釋液添加抗氧化劑Fenozane和epihyd能提高解凍后鏡子活力。后一種還能提高授精率。

2.5 棉籽糖類稀釋液

Varnaskij等（1974）試驗結(jié)果表明，在棉籽糖-檸檬酸鹽-卵黃和棉籽糖-乳糖-卵黃液中冷凍的綿羊精液的產(chǎn)羔率略高于乳糖-卵黃液。

2.6 三基類稀釋液

三基[teis（hydroxymethyl）aminomethane]（三羥甲基氨基甲烷）高濃度對精子毒性低，具有良好的緩沖性、利尿性和滲透性。Salamon等（1972）酒漿三基-葡萄糖稀釋液應用于試驗中，并于1976年推薦作為綿羊精液冷凍稀釋液。

2.7 其他稀釋液

Good等（1996）提出的兩性離子緩沖劑如N-三基（羥甲基）甲基-2-氨基磺酸（tes）、N-2（羥乙基）哌嗪-n-2-乙烷磺酸和哌嗪-N、N-bis（2-乙烷磺酸）（pipes）的緩沖性能優(yōu)于三基。哈福，趙有璋等（2003）證實，將山梨醇、氯前列烯醇、復合維生素B在綿羊冷凍精液稀釋液中進行添加、篩選。解凍后活率結(jié)果顯示，1號稀釋液（41.17±4.72）%和4號稀釋液（37.76±3.15）%極顯著地高于對照組稀釋液（22.80±4.49）%（P〈0.01）。表明，在綿羊凍精稀釋液中添加復合維生素B可有效提高凍精解凍后活率并保護精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性（2）。

3 綿羊精液冷凍保護劑

已證實多種制劑和物質(zhì)可作哺乳動物精子的低溫保護劑，其中甘油和卵黃是最常用的綿羊冷凍保護劑。

3.1 甘油

甘油的保護作用與甘油能濃縮或結(jié)合細胞內(nèi)水有關。另外還有稀釋作用，可降低溶液中鹽的解離度和冷凍液的滲透壓。另據(jù)Milovanov（1962）研究甘油還有阻礙冰晶核形成和增長的性能及滅菌作用（3）。因此是較好的低溫保護劑。

3.2 卵黃

卵黃有維持精子活力、保護精子頂體和線粒體膜的作用。它還是一種“滲透性緩沖劑”，使精子能耐受低滲和高滲，且其濃度范圍較大。

3.3 其他

由于甘油最大的缺點是，它對精子的活力和授精力的毒害作用，這就激發(fā)人們對頂體保護作用的其他試劑和抗凍劑的研究。如侯藎褒用乙酰胺在小尾寒羊的精液冷凍試驗中，解凍后精子活力最高為45%，幾次平均值為26%（4）。

3.4 稀釋比例

Platko（1965）的對比試驗結(jié)果證明，4倍和8倍稀釋的凍精存活率提高2倍和16倍。現(xiàn)在人們常用的最終稀釋比例（精液于稀釋液之比）：顆粒精液為1∶1，安瓿精液和細管精液為1∶3（顆粒精液及安瓿精液采用兩次稀釋法，細管精液采用一次稀釋法）。

4 綿羊冷凍精液平衡

精液稀釋后的平衡是最早由Polge 等[5]在研究公牛精液冷凍方法時提出的。平衡的溫度一般為4℃～5℃，精液經(jīng)過平衡處理后能夠改進冷凍效果。精液稀釋后逐漸降溫到4℃的過程是精子代謝減少的適應過程。過慢或過快的冷卻速率會導致精細胞膜脂蛋白復合體被破壞和膜被分解。當細胞膜脫水收縮達到臨界最小體積時，又會使細胞膜的滲透性產(chǎn)生不可逆的損傷，原來不能透過膜的溶質(zhì)變成可滲透性的，進而造成細胞損傷或死亡（Mazur[6]）。有資料報道山羊精液在冷凍前的平均損傷率為19.4 %，冷凍后的平均損傷率為17.1 %。因此，平衡方法對冷凍精液的品質(zhì)有重要影響。

4.1 平衡方法

（1）在30℃的環(huán)境下，分裝稀釋精液于細管內(nèi)，并用聚氯乙烯醇粉末封口，隨后在5℃的環(huán)境中平衡1.5 h；（2）在30候℃環(huán)境下把稀釋精液放入管內(nèi)，與細管一起在5 ℃的環(huán)境中平衡1.5 h，而后在5℃環(huán)境中分裝（7）

4.2 平衡時間

早期的研究者應用兩步法冷凍精液時對最適平衡時間持不同觀點。Lopatko[8]在精液冷凍實驗中使用12～16 h的平衡時間，而Fiser et al.[9]傾向于較短的平衡時間。Lapatko[10]在考察了0～20 h范圍的平衡時間之后認為，最佳平衡時間為4 h。Jones et al.[11]報道平衡時間與稀釋比例有關。Salamon[12]通過實驗發(fā)現(xiàn)應用二次稀釋法冷凍顆粒精液的最佳平衡時間是2.5 h。Lightfoot[13]的研究證實，顆粒冷凍精液的平衡時間與糖的類型及甘油的濃度有關。Bauer et al.[14]報道平衡2 h和6 h的產(chǎn)羔率分別是43%和3%。而陳亞明，趙有璋等（2002）推薦生產(chǎn)實踐中應用200 ml體積水浴2.5 h降溫到4 ℃的平衡方法（15）。

5 綿羊精液分裝與冷凍

5.1 分裝方法

（1）在玻璃安瓿或塑料細管上加印精液紡號及冷凍日期等標記。

（2）安瓿精液 經(jīng)過二次稀釋后的精液，立即在3℃～4℃下進行分裝（1 ml安瓿）和火焰封口。

（3）細管精液 用5 ml注射器，在室溫下分裝與0.25 ml細管內(nèi)，并隨即用塑料株或聚乙烯醇封口。細管精液不宜過滿，封口后中間應保留一定空隙，以防解凍時細管暴烈。

5.2 冷凍方法

5.2.1 顆粒精液

①干冰法：用特制扎孔器或普通玻璃棒在預先攤平，壓實的干冰上戳上排列整齊的齊圓光滑的小孔（直徑0.4 cm，深2～2.5 cm）再用滴管吸取稀釋混勻的精液，按0.1 ml容量逐穴滴凍，經(jīng)4～5 min即可揀取，存放與液氮中。

②液氮法：先將液氮注入12磅廣口溫瓶內(nèi)，隨后放置漂浮冷凍器，鋼網(wǎng)面保持以地溫溫度計測試溫度，隨時調(diào)節(jié)漂浮冷凍器銅網(wǎng)與液氮面的距離（約3 cm），確保銅網(wǎng)面溫度保持在-80℃左右，用滴管吸取精液，按每粒0.1ml滴凍。加蓋停留4 min浸入液氮，用小勺收取。精液分批冷凍，第二批滴洞前，需用干紗布將銅網(wǎng)面擦凈。

5.2.2 安瓿精液

安瓿精液由直徑25 cm、深20 cm的鋁筒，周圍加5 cm厚保溫材料并固定在特制木箱里的液氮槽和一個直徑18 cm、深3～4 cm帶網(wǎng)眼的漂浮器制成簡易冷凍器，冷凍時，向液氮槽內(nèi)注入約1 L液氮，將約40支安瓿精液平放入漂浮器，置于距液氮面2 cm處，停留7 min后浸入注入液氮。

5.2.3 細管精液

常用與羊的冷凍細管：0.5 ml 法國細管，0.25 ml法國細管和0.25 ml德國微細管。細管精液冷凍一般是在液氮汽中，通過調(diào)節(jié)細管與液氮面的距離來控制降溫速度。細管精液降溫速度變化曲線的形狀是很重要的，不應呈線性。Milovanov等（1980）認為，降溫曲線是符合t=T2/2p公式的拋物線，其中t代表精液溫度，T是降溫開始后的時間（分鐘），p是拋物線參數(shù)（決定曲線坡度）。已證實對綿羊精液最適合的參數(shù)是0.01～0.15，可以通過調(diào)節(jié)細管與液氮面的距離來達到。

6 解凍

解凍同冷凍過程一樣必須迅速通過精子冷凍的危險區(qū)（-15℃～-60℃），才不至于對精子造成損害，這主要取決于降溫速度是否高到足以引起精細胞內(nèi)液體的凍結(jié)和降低到足以引起精細胞脫水（Park等1992）。

6.1 細管凍精的解凍

近年來，綿羊細管冷凍精液的解凍溫度和時間變化很大，如Maxwell.W.M.C.et al（1994）直接將細管投入37℃水中60 s，而后吹出精液與37℃水浴鍋的試管中，檢查火力；Ingrid Olesenz（1993）直接把0.25 ml微細管放于70℃水浴中解凍8 s；澳大利亞西沃大學畜牧科學院介紹他們牧場的解凍方法：從液氮中取出細管，在37℃的水中搖動4 s，剪開一段，把精液吹入38℃的水浴鍋的容器內(nèi)，10 s后吸出0.1 ml進行腹腔內(nèi)窺鏡輸精。Johnson等（1974）發(fā)現(xiàn)，69.5℃解凍有利于提高存活率，而慢速解凍（45.6℃）有利于保護精子頂體。

6.2 安瓿凍精和顆粒凍精解凍

綿羊安瓿凍精解凍較好的方案是慢速解凍（室溫下，15℃/ min）。也有報道說安瓿解凍可在37℃的溫水中解凍，顆粒解凍可以在解凍液（濕解凍）或試管中（干解凍）。起初報道，濕解凍優(yōu)于干解凍，另一些研究中，30℃～45℃間存活率沒有太大差異，37℃下干解凍存活率高于45℃，60℃或75℃的濕解凍（Fukui，1979）。

7 結(jié)論

精液冷凍保存和輸精技術的掌握是關系到人工授精和胚胎移植技術的發(fā)展，關系到種公羊的利用和經(jīng)濟效益的提高的龍頭技術，只有牢固掌握稀釋液種類及其成分及添加方法，冷凍保存濃度，凍前稀釋，降溫及解凍速度及方法和子宮深部輸精技術，才能將人工授精和胚胎移植技術推向發(fā)展。但是，目前凍精授精率還不盡如人意，這就需要我們深入研究其中的原因和采用好的冷凍輸精技術。

[1] 哈福，趙有璋.羊冷凍精液稀釋液中添加復合維生 素B提高凍精解凍后品質(zhì)的研究 甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2002，（3）：17-19.

[2] Polge C，smith A U，Parkes，A S. Revival of spermatogoa after vitrification and dehydration at low temperature[J]. Nature，1949，（164）：666

[3] Mazur R C. The rule of intracellular freezing in the death of cells cooled at supraoptimal rates[J]. Cryobiology，1977，（14）：251.

[4] Lopatko M I. Method of freezing ram semen at temperatures of ?83 or ?96℃（in Russian）[J]. Zhivotnovodstvo. 1962，（10）：86-88.

[5] Fiser P S. Faithfull R W. The effect of rapid cooling，cold shock of ram semen，photoperiod，and egg yolk in diluents on the survival of spermatozoa before and after freezing[J]. Cryobiology，1986，（23）：518-524.